Применение днк чипов в микробиологии. Биологические микрочипы

Важной инновацией молекулярной биологии стала технология биологических микрочипов. Эта технология позволяет использовать сравнительно небольшие количества исходного материала, проводить реакцию в микрообъемах, одновременно осуществлять многопараметрический анализ множества генов одного и того же объекта.

Ее чувствительность сопоставима со стандартными амплификационны- ми методами ДНК-диагностики и в некоторых случаях превосходит их .

В зависимости от природы иммобилизованных зондов различают 4 основные типа биочипов:

ДНК-чипы;

РНК-чипы;

Белковые микрочипы;

Клеточные микрочипы.

Наибольшее распространение в исследовательской и клинической практике, особенно для анализа спектра различных мутаций или

аллельных вариантов разных генов, получили ДНК-чипы. В типичном варианте они представляют собой миниатюрные гелевые пластинки с многочисленными углублениями, ячейками, содержащими набор ДНК-зондов (рис. 4.10), расположенными на стекле или мембране. За последние десять лет технология микрочипов превратилась в бурно развивающееся прикладное направление биологической науки: десятки фирм разрабатывают и предлагают биологические микрочипы, содержащие массивы от нескольких десятков до сотен тысяч и более ДНК-зондов . С помощью биочипов можно также анализировать и такие изменения ДНК, как транслокации, дупликации, протяженные делеции, а также микродупликации и микроделеции .

Технологии изготовления ДНК-чипов различаются размером наносимых фрагментов ДНК, методами иммобилизации, процедурами гибридизации и системами детекции . По конечному этапу детекции микрочипы бывают двух типов: гибридизационные и ферментативные. Гибридизационные чипы в зависимости от способа считывания сигнала подразделяются на электронные (фирма “Nanogen”) и флюоресцентные (фирмы “Affymetrix”, “Illumina”, «Биочип») и т. д. [Биочип: www.biochip. rn; Affymetrix: www.affymetrix.com; Applied Biosystems: www.europe. appliedbiosystems.com; Asper Biotech: www.asperbio.com; Illumina: www. illumina.com; Nanogen: www.nanogen.com].

При этом дискриминация мутаций может происходить как до гибридизации, то есть еще в процессе подготовки пробы (чипы фирм “Applied Biosystems”, “Affymetrix”), так и в процессе гибридизации (фирма «Биочип»). Для примера проиллюстрируем гибридизацион-

Рис. 4.11. Метод анализа мутаций на основе аллель-специфичной гибридизации, разработанный в ИМБ РАН (пояснения в тексте)

ные методы анализа мутаций, используемые фирмами «Биочип» (1) и «Affymetrix» (2).

1. Предложенная и разработанная в России технология микрочипов (Институт молекулярной биологии им. В. А. Энгельгардта РАН) предполагает предварительную мультиплексную амплификацию исследуемых фрагментов ДНК с использованием флюоресцентно меченных праймеров (или дезоксинуклеотидтрифосфатов) . В результате добавления избытка одного из праймеров и проведения 2 раундов репликации достигается образование большого количества преимущественно меченого одноцепочечного продукта. Последний наносят на биочип, где он гибридизуется с иммобилизованными в геле олигонуклеотидными зондами (рис. 4.11). Если последовательность анализируемой ДНК полностью комплементарна последовательности ДНК-зонда, образуется стабильный дуплекс, который легко детектируется благодаря флюоресцентной метке. Однако, если искомого фрагмента нет или в нем присутствует некомплементарное основание, то стабильный дуплекс не возникает (сигнал флюоресценции отсутствует). Данный метод позволяет анализировать до 50 полиморфных вариантов с точностью более 98 %.

2. Для анализа генетического полиморфизма и мутаций, используя технологию “Affymetrix” , предполагается при-

менение так называемых «специальных проб». Такие пробы состоят из нескольких фрагментов: H1 и H2 - специфичных для анализируемой последовательности ДНК; P1 и P2 - являющихся универсальными праймерами и фланкирующих сайт для фермента клевазы; и tag-последовательности - специфической метки для выявления определенного SNP при гибридизации на микрочипе (рис. 4.12). Детекция мутаций происходит следующим образом: в исследуемый образец, содержащий одноцепочечную ДНК с искомой мутацией, добавляют «специальную пробу». Проба комплементарно гибридизуется с последовательностью ДНК анализируемого образца (фрагментами H1 и H2) (рис. 4.12 А). Далее добавляют термостабильную ДНК-полимеразу и четыре разных нуклеозидтрифосфата (используют, соответственно, четыре пробирки). ДНК-полимераза достраивает 3’-конец пробы H1 на одно основание, соответствующее вариабельной позиции (рис. 4.12 B). Затем проводят лигазную реакцию, при которой происходит соединение 5’-конца встроенного основания с 3’-концом пробы H2 (рис. 4.12 С). На следующей стадии (рис. 4.12 D) экзонуклеаза разрушает оставшуюся ДНК исходного образца. С целью дальнейшей амплификации кольцевую молекулу пробы разрезают клевазой (рис. 4.12 E). Амплификацию проводят с использованием универсальных праймеров P1 и P2 (рис. 4.12 F). Далее пробы гибридизуют с микрочипом. Специфичность гибридизации достигается за счет специально сконструированного tag-фрагмента, который, наряду с универсальными праймерами, является одним из ноу-хау фирмы “Asymetrix”. Таким образом, в исследуемом образце можно однозначно выявлять до 1000 и более SNPs. Точность метода при анализе тысячи SNPs составляет около 90 %.

3. Еще один из перспективных вариантов биочипов для анализа генетического полиморфизма сконструирован на основе метода SBE (single base primer extension - удлинение праймера на одно основание), позволяющего достигать высокой степени дискриминации гиб- ридизационных сигналов на аллелях «мутантного» и «дикого» типов. При подготовке проб предварительно амплифицируют исследуемый фрагмент ДНК, содержащий маркерный SNP, после чего проводят его гибридизацию на биочипе. Последовательность зонда должна быть комплементарна последовательности исследуемой ДНК, включая его последнее основание на З’-конце, после которого следует вариабельный нуклеотид. Принцип детекции заключается в следующем: после гибридизации зонда с образцом в реакцию добавляют меченные разными красителями дидезоксинуклеотиды и ДНК-полимеразу. Благодаря присутствию дидезоксинуклеотидов возможно присоединение только одного-единственного нуклеотида к 3’-концу иммобилизованного зонда. После отмывки чипа флюоресценция тестируемой пробы определяется именно этим меченым дидезоксинуклеотидом. По степени дискриминации между гомозиготными и гетерозиготными генотипами метод SBE в среднем на порядок превосходит гибридизацию с аллель- специфичными зондами . Недостатки этого метода состоят в необходимости синтеза олигонуклеотидов, иммобилизованных на чипе со свободным З’-концом, что исключает применение метода для наиболее перспективного типа чипов, создаваемых способом фотолитографии.

4. Концептуально близкой технологии SBE являются биочипы, созданные на основе метода APEX (arrayed primer extension - достройка праймеров, синтезированных на обеих цепях ДНК). Отличие состоит в том, что при анализе тестируется не одна, а сразу обе цепи ДНК и используются несколько различных иммобилизованных зондов для каждой позиции. Это дает возможность идентифицировать с высокой степенью надежности новые мутации и полиморфные сайты. Чипы на основе APEX-технологии разработаны эстонской фирмой «Asper Biotech» , показаны на рисунке 4.13.

5. Несколько вариантов гибридизационных биочипов были разработаны на базе НИИ АГ им. Д. О. Отта СЗО РАМН. С помощью одного из

DNA from Client

PCR with ~20 % dUTP

DNA (PCR product ~100-1000 bp)

UNG and SAP treatment

DNA ~20-25 bp)

\ To Genorama™ QuattroImager

них - «фармакогенетического биочипа» - можно изучать наследственную предрасположенность к привычной невынашиваемости беременности и к лейкозам у детей . Биочип позволяет проводить анализ 13 аллельных полиморфных сайтов 7 генов системы детоксикации: CYP1A1 (4887С>А,4889A>G и 6235T>C), CYP2D6 (1934G>A и 2637delA), GSTM1 (делеция), GSTT1 (делеция), NAT2 (481T>C,590A>G и 857A>G), CYP2C9 (430С>Г и 1075C>T) и CYP2C19 (681G>A) и одного (677C>T) гена метилентетрагидрофолиевой кислоты - MTHFR. На рисунке 4.14 приведены результаты биочипового анализа с применением специального программного обеспечения. «Фармаген-биочип» уже прошел клинические испытания и внедрен в практику лабораторной диагностики нескольких медицинских центров РФ. На стадии клинических испытаний находятся биочипы для тестирования наследственной предрасположенности к тромбофилии («ТРОМБО-биочип») и к сердечно-сосудистым заболеваниям («Кардиобиочип») . Ведется работа по созданию биочипов по тестированию основных мутаций в гене СFTR при муковисцидозе, а также наследственной предрасположенности к бронхиальной астме и остеопорозу.

6. Особого внимания заслуживают биочипы, позволяющие осуществлять общегеномный скрининг ассоциаций (Genome Wide Association Studies - GWAS) ,

Nsp I Nsp I Nsp I

RE Digestion

в результате которого становится возможной идентификация всех генов-маркеров, геномных локусов и отдельных маркерных SNP, ассоциированных с различными МФЗ (см. гл. 2, 3, 9). С этой целью исследуемый образец ДНК подвергают гидролизу определенными эндонуклеазами, образовавшиеся фрагменты лигируют (сшивают) с адаптерными последовательностями ДНК и амплифицируют с одним праймером, специфичным исследуемому фрагменту генома. Полученные фрагменты ПЦР метят флюоресцентными красителями и гибридизуют с наборами ДНК-зондов, находящихся на биочипе (рис. 4.15). По результатам анализа гибридизационной картины биочипа с помощью специальной компьютерной программы судят о наличии в исследованном образце того или иного набора аллельных вариантов однонуклеотидных замен - SNP (рис. 4.16). Сопоставление частот соответствующих аллелей у больных и здоровых индивидов позволяет идентифицировать все SNP и, соответственно, все гены и ДНК-ло- кусы, ассоциированные с конкретной болезнью, то есть выяснить специфический генетический профиль МФЗ. Метод позволяет в одном анализе исследовать до нескольких десятков и сотен тысяч маркеров, однако его точность не превышает 90 %. Поэтому на современном эта-

пе данный метод следует рассматривать скорее как поисковый, но не диагностический. В настоящее время метод с успехом применяется для полногеномного скрининга ассоциаций различных МФЗ, включая диабет тип 1 и тип 2, коронарную болезнь, бронхиальную астму, болезнь Крона, маниакально-депрессивный психоз и др. (см. разделы 1, 6.1, 6.3, 9).

7. Существенным продвижением в повышении эффективности, точности и стоимости тестирования мутаций явились разработки последних двух лет, направленные на совмещение несомненных преимуществ метода ПЦР в реальном времени с принципами биочиповой диагностики (рис. 4.17). Так, с помощью биочипа фирмы “Fluidigm” можно одновременно анализировать мутации или тестировать SNP в 9216 локусах. Метод имеет большую специфичность и точность, чем метод полногеномного скрининга GWAS (см. раздел 4.6.). Себестоимость исследования одной мутации/поли- морфизма не превышает 1 рубля.

Use your existing TaqMan assays: 99% assay conversion rate from 384-well system

Образец добавляют к микросферам, аналит связывается с микросферами
Рис. 4.19. Гибридизация на микросферах (www.perkinelmer.com) (пояснения в тексте)

ДНК-микрочип - это как правило небольшая отполированная кремниевая пластина, на поверхности которой закреплены специальные ДНК-зонды. Именно зонды отвечают за распознавание ДНК. Зонд - это небольшой искусственно синтезированный участок ДНК, который нацелен на выявление одной единственной мутации. На чипах разных производителей от нескольких сотен до нескольких миллионов зондов, и каждый представляет уникальную мутацию.

Перед анализом на чипе ДНК выделяют, например, из слюны, очищают от посторонних веществ и нарезают на небольшие фрагменты.

Затем раствор с этими фрагментами наносят на чип и оставляют на время. Эта стадия называется инкубацией. В течение этого времени фрагменты исследуемой ДНК проникают между зондами на чипе, и далее процесс может пойти по двум путям. В одном случае, если последовательность фрагмента ДНК зеркальна (комплементарна) по отношению к последовательности ДНК зонда, произойдет слипание (гибридизация), потому что комплементарные участки ДНК подходят друг к другу как края застежки-молнии. Если же фрагмент похож на зонд лишь отчасти или не похож вообще, гибридизации не произойдет и он продолжит свободно плавать между зондами.

После инкубации наступает стадия отмывки, призванная удалить несвязанные фрагменты с чипа. При этом удаляются не только свободные фрагменты, но и те, которые загибридизовались лишь частично. Если гибридизация происходит частично, значит фрагмент не полностью подошел в зонду и его нужно убрать. Полностью комплементарные фрагменты ДНК настолько хорошо держатся за зонд, что не смываются на этой стадии.

После отмывки на чипе остаются зонды, связанные с участками ДНК человека, и свободные зонды.

На финальной стадии происходит выявление тех зондов, с которыми связались фрагменты исследуемой ДНК. Здесь подходы различаются. Например, на чип наносится специальная светящаяся метка, которая прочно соединяется только со "сработавшими" зондами. Несвязанные метки снова отмываются, а затем чип фотографируется под микроскопом. Получается сетка из множества разноцветных точек с разной яркостью. Зная, в какой точке какой зонд расположен, можно понять, какие именно последовательности ДНК есть у человека, то есть какими мутациями он обладает.

Исследуемую ДНК нарезают специальными ферментами, рестриктазами, которые распознают в последовательности нуклеотидов особые сочетания и режут по ним. Эти особые сочетания нуклеотидов разбросаны по ДНК достаточно равномерно, поэтому фрагменты получаются достаточно однородными по длине.

Равномерность нанесения на чип достигается тем, что фрагменты наносятся в виде раствора. А в нем уже тепловое (броуновское) движение распределяет моелкулы равномерно. Остается нанести каплю раствора на на то место чипа, где находятся зонды. А это не сложно - обычно такое окно на чипе имеет размеры не более 10х10 мм.

Ответить

Прокомментировать

В последнее время активно развиваются ДНК-технологии, которые позволяют не только определять признак, но и одновременно проводить дифференциальный сиквенс, т.е. определение точечных мутаций или полиморфизма в известных участках генома. Данные технологии имеют значительные преимущества перед традиционными молекулярно-биологическими методами, т.к. они позволяют миниатюризировать исследуемый образец и анализатор, что значительно снижает стоимость анализа и время его проведения, а также одновременно определять различные параметры исследуемого образца, причем без потери чувствительности амплификационных методов. Главным преимуществом методов основанных на использовании чипов с олигонуклеотидами всех возможных нуклеотидных последовательностей данной длины, является их универсальность. Наличие на чипе олигонуклеотида любой последовательности делает возможным анализ любой исследуемой последовательности. В основе применения микрочипов лежит принцип быстрого определения взаимодействий тех или иных лигандов со множеством различных зондов одновременно. Собственно биологические микрочипы представляют собой ту или иную твердую подложку, на которой нанесены или определенные фрагменты нуклеиновых кислот, или белки, или углеводы, или какие-либо иные молекулы-зонды, способные быть узнанными или проявлять биологическую активность. Количество различных зондов на подложке может достигать сотен тысяч, причем чипы каждого типа строго идентичны и при существующих технологиях могут быть реплицированы в сотнях тысяч и миллионах копий нанесенных на подложку.

ДНК-микрочипы

Существуют белковые, ДНК, углеводные, тканеые чипы. Особого внимания заслуживают ДНК-чипы. Они представляют собой уникальный аналитический инструмент, позволяющий определять наличие в анализируемом образце (как правило, биологического происхождения) заданных последовательностей ДНК (т.н. гибридизационный анализ). Проведение анализа с помощью ДНК–чипов обходится в несколько раз дешевле, чем при использовании альтернативных технологий (электрофорез, ПЦР в реальном времени) и допускает, при наличии детектора несложной конструкции, работу вне лаборатории.

Впервые ДНК–чипы были использованы в исследованиях в конце 80-х годов прошлого века. В основе этого теперь уже широко распространенного метода, позволяющего одновременно анализировать экспрессию множества генов, лежит принцип узнавания мРНК-овых или кДНК-овых мишеней посредством их гибридизации с иммобилизованными на микрочипе одноцепочечными фрагментами ДНК.

ДНК–чип – это твердая подложка, на которой иммобилизованы (как правило, ковалентно) однонитевые фрагменты ДНК разной длины: короткие – 15-25 нуклеотидов, длинные – 25-60 нуклеотидов и кДНК фрагменты – от 100 до 3000 нуклеотидов. В качестве материала подложки используют стекло, кремний, различные полимеры, гидрогели (например, на основе полиакриламида) и даже золото.

Гибридизация-основа технологии

Основа всех современных ДНК-технологий – гибридизация. В результате гибридизации молекулы нуклеиновых кислот способны формировать устойчивые двухцепочечные структуры благодаря связям между элементами молекул - нуклеотидами. Нуклеотид аденин (А) комплиментарен тимину (Т), гуанин (Г) - цитозину (Ц). В результате одноцепочечная последовательность нуклеотидов АТГЦ будет образовывать стабильную ассоциацию, двухцепочечную структуру, с одноцепочечной молекулой ДНК состава ТАЦГ.

….. АТГЦ….

| | | |

….. ТАЦГ….

Подобная комплементарность приводит к «слипанию» двух молекул ДНК, одна из которых может быть неподвижно закреплена на подложке, и являться элементом ДНК-чипа. Чем больше содержится в образце молекул комплиментарных элементам чипа, тем больше их будет связываться с чипом, и тем выше будет интенсивность сигнала, воспринимаемого от данного элемента. На рис. 1 показан принцип действия ячейки ДНК или олигонуклеотидного биочипа, основанный на комплементарных взаимодействиях основания аденина (А ) с тимином (Т ) и гуанина (G ) с цитозином (С ) в двух нитях ДНК. Если последовательность оснований в одной нити ДНК (или олигонуклеотида) полностью комплементарна последовательности другой нити, то образуется стабильная совершенная двухнитчатая спираль - дуплекс. Однако присутствие в дуплексе даже одной неправильной пары, например G-G , предотвращает образование дуплекса. Если иммобилизовать в одном из элементов микрочипа специфическую одноцепочечную ДНК или, положим, 20-мерный олигонуклеотид (пробу), то при добавлении к микрочипу меченных флюоресцентными красителями фрагментов ДНК, например генома человека, будет происходить их высокоспецифичное взаимодействие. Заданный олигонуклеотидный элемент биочипа специфически свяжет только одну комплементарную последовательность из 4 20 =1.09х10 12 всех возможных последовательностей этой длины в ДНК. В результате флюоресцентное свечение наблюдается только на этом комплементарном элементе биочипа. Таким образом, один элемент биочипа производит одну выборку примерно из триллиона возможных вариантов, в отличие от элемента электронного чипа, где происходит двоичная выборка: ДА или НЕТ .

Рис. 1. Схема образования двойной спирали ДНК на биочипе. Олигонуклеотид фиксирован на одном из элементов биочипа и избирательно связывает из многих флуоресцентно меченых фрагментов ДНК только комплементарный. В результате только этот элемент начинает светиться. Это происходит благодаря высоко-специфичным взаимодействиям комплементарных пар нуклеотидов А с Т и G с С. Присутствие некомплементарной пары, например G-G , предотвращает взаимодействие и оставляет элемент микрочипа темным.

Используемые для определения параметров гибридизации устройства позволяют регистрировать не только конечный результат, но и кинетику ассоциации и диссоциации комплементарных цепей. Эти технологии, делая возможным многопараметрический анализ образцов, могут предоставлять большое количество информации. Результаты гибридизации зависят от длины ДНК - пробы, химического состава меченой ДНК - мишени, температуры, при которой проводится гибридизация, состава гибридизационной смеси, типа флуоресцентной метки. Здесь необходимо отметить, что в ДНК-чипах в основном используется пассивная гибридизация, т.е. взаимодействие ДНК-мишени с иммобилизованной пробой является вероятностным процессом и зависит от различных условий.

Применение ДНК-чипов

Оценка состояния и идентификация всех генов исследуемого организма является одной из важнейших задач, поставленных перед разработчиками ДНК-чипов. Решение этой задачи может быть реализовано в иммобилизации всех генов организма на биологический чип, что позволит комплексно оценить состояние генов и генома в целом. Биогенетические базы данных, содержащие всю информацию (систематизированную) по генам и геномам различных организмов, представляют исследователям огромные возможности в дизайне ДНК-чипов.

К основным причинам широкого распространения биочиповых исследовианий относят высокую чувствительность, специфичность и воспроизводимость, простоту процедуры выполнения, возможность одновременного анализа множества параметров и относительно невысокую стоимость работ. Эти же причины заставляют рассматривать биочипы как перспективный инструмент в различных областях народного хозяйства.

Подводя некоторые итоги нужно отметить, что микрочипы являются эффективным подходом для одновременной идентификации от десятков до тысяч генов и их структурного анализа, для выявления специфичных нуклеотидных последовательностей и нуклеотидных вариаций в их структуре. Однако, когда гены присутствуют в геноме в количестве одной или нескольких копий, с чем постоянно и приходится сталкиваться в клинической практике, требуется их предварительная амплификация. Наиболее эффективным методом амплификации ДНК является полимеразная цепная реакция, в процессе которой происходит экспоненциальное увеличение количества молекул ДНК от нескольких до миллионов и более копий, а основное достоинство такого вида ПЦР как Real Time, позволяют давать даже количественную оценку исследуемой матрицы. Это имеет важное значение для решения задач в области развития фундаментальных и интегральных наук, а так же оптимизации условий методов диагностики.

Итак, два метода, ставшие уже традиционными для некоторых областей науки и прикладных технологий, на ряду со своими недостатками имеют совершенно уникальные достоинства.

RealTime ПЦР:

· дает возможность оценивать количество исходной матрицы;

· не требует дополнительных трудоемких этапов работы;

· отсутствие стадии электрофореза позволяет минимизировать риск контаминации и таким образом уменьшить число ложноположительных результатов;

· использование математических методов анализа позволяет проводить автоматическую интерпретацию полученных результатов и снимает проблему субъективной оценки электрофореграмм;

· обеспечивает менее строгие требования к организации ПЦР-лаборатории и автоматической регистрации и интерпретации результатов;

· позволяет экономить время.

Биологические микрочипы:

· позволяют миниатюризировать образец и анализатор;

· экономит время и стоимость анализа;

· позволяет одновременно определять несколько параметров исследуемого образца;

· убладает высокой чувствительностью амплификационных методов, специфичностью и воспроизводимостью;

· обеспечивает простоту процедуры выполнения работы.

Возможно, что объединие этих методов за счет перевода полимеразной цепной реакции в формат микрочипов позволит создать диагностическую систему нового поколения, которую будут характеризовать следующие качества: более высокая чувствительность и, главным образом, специфичность определения нуклеиновых кислот, высокая производительность при низкой себестоимости выполнения анализа, общее сокращение количества манипуляций в пределах каждого этапа анализа.



Юная калифорнийская компания Affymetrix (начавшая свою работу в 1993 году) - один из фаворитов рынка устройств для генетических исследовательских работ.

Компания известна своим революционным соединением технологий полупроводниковой, так сказать, «микросхемной», индустрии и биохимических тестов.

ДНК-чипы от Affymetrix обширно употребляются в различных лабораториях, занятых генетическим анализом и генной инженерией.

Но обыденным людям куда увлекательнее другой продукт компании. Это прибор, схожий на микросхему, позволяющий идентифицировать 10-ки ДНК от разных животных в образчике людской еды.

bioMerieux FoodExpert-ID практически - разновидность так именуемого GeneChip.

Прибор может идентифицировать био следы в еде от 12 разновидностей млекопитающих, 5 видов домашней птицы и 16 разновидностей рыбы.

Таким макаром, он позволяет выяснить, вправду ли гусиный паштет, вызывающий у покупателя подозрения, содержит гусиную печень, а не что-то ещё.

ДНК-чип создаётся по технологиям, схожим с компьютерными, но это не электрический, а био объект (иллюстрация с веб-сайта affymetrix.com).

А, например, мусульмане могут проверить - не положили ли нерадивые изготовители свинину в «говяжьи» котлеты.

Всё это, правда, работает, только с привлечением дополнительных лабораторных способностей, так что использовать чип в «нагом» виде, на коленке, обычному потребителю не получится.

Чтоб осознать, как работает FoodExpert-ID, необходимо вспомнить самую малость из генетики: двойные спирали ДНК, составляющие их молекулы-основания - аденин, гуанин, тимин и цитозин, также то, что они могут соединяться только попарно, как будто ключи и замки.

ДНК-чип содержит мириады и мириады «располовиненных» фрагментов ДНК-кода.

Кусок поверхности чипа с молекулами-ключами (иллюстрация с веб-сайта affymetrix.com).

Поверхность чипа размером с ноготь разбита на 97 тыщ квадратиков, нареченных «особенностями».

Любая «особенность» поперечником примерно 26 микронов содержит только один ДНК-код. Поточнее много-много схожих молекул.

И они все совершенно точно относятся к одному из 33 животных.

Длина каждого куска - 17 оснований. Этого довольно для надёжной идентификации, как довольно 17 взятых попорядку в любом месте нот, чтоб найти какую-нибудь мелодию из имеющейся базы данных.

Целую россыпь разбитых кусочков ДНК экспериментаторы выделяют из эталона еды. Чего там только нет. А чего?

«Некорректные» куски генетических кодов смываются, а совпадающие - закрепляются на чипе. Красноватые шарики - флуоресцентные молекулы (иллюстрация с веб-сайта affymetrix.com).

Добавим к молекулам, составляющим генетический код, молекулы флуоресцирующего вещества. Нанесём эту смесь на поверхность FoodExpert-ID. Осталось сделать малость.

Все совпадающие куски кода объединятся со своими «родными» последовательностями в той либо другой «особенности».

Сейчас чип можно помыть водой - всё избыточное уйдёт. Чип помещают под луч лазера, и квадратики, содержащие отловленный материал будут ярко сиять. Осталось только свериться с картой чипа, чтоб выяснить - какие ДНК определены.

А по интенсивности свечения можно сделать косвенный вывод и о пропорциях свинины и говядины в нашей гипотетичной котлете.

Как лицезреем, внедрение чипа сравнимо нетрудно, и позволяет заниматься генетическим анализом лабораториям, имеющим очень обычный набор оборудования.

Но как же хитроумно создание чипа. Чтоб создавать такие биохимические шедевры автоматизировано и в массовом порядке, Affymetrix соединила принципы фотолитографии и комбинаторной химии.

Цветные квадратики - «особенности», отвечающие за идентификацию того либо другого ДНК-кода (иллюстрация с веб-сайта affymetrix.com).

Начальный продукт - кварцевая пластинка - покрывается особым реактивом, силаном, который крепко соединяется с кварцем и сформировывает строго периодичную молекулярную матрицу (с равномерной поверхностной плотностью), готовую принять нуклеотиды.

В цепочках грядущего кода основания идут вертикально ввысь, а наносят их сразу на всю поверхность, слой за слоем.

Очевидно, всякий раз на чип подают определённое вещество, и чтоб оно закрепилось исключительно в определённых «особенностях», тех микронных квадратиках, употребляют маски, подобные тем, что необходимы для производства микросхем.

Снимок прореагировавшего чипа с огромным повышением. Белоснежные, красноватые, жёлтые квадратики - участки с высочайшей концентрацией флуоресцентного вещества. Зелёные, голубые, чёрные - соответственно, со всё более и поболее с низкой (иллюстрация с веб-сайта affymetrix.com).

С основой чипа всякий раз сцепляются только те основания, что освещаются через отверстия в маске ультрафиолетом.

В этом процессе поочередного синтеза главное - всякий раз накладывать новейшую маску с микронной точностью, по другому все генетические коды на пластинке перемешаются.

Так, шаг за шагом (в пищевом чипе их 17, в других моделях компании - до 24) формируются вертикальные столбики нуклеотидных цепей, которые и делают ключи-анализаторы генов.

Эта разработка служит, естественно, не только лишь для таких смешных (на 1-ый, может быть, взор) областей внедрения, как выявление мяса поросёнка в гусином паштете, да и для полностью серьёзных исследований.

Ведь на поверхность чипа, на теоретическом уровне, можно нанести куски каких угодно генетических кодов.

Работа Affymetrix - избыточное подтверждение, что самые достойные внимания и многообещающие открытия происходят на соединениях наук и дисциплин.

Похоже на био обилие в природе, получаемое смешением генов. Не так ли?

Специфической последовательности. Олигонуклеотид может являться коротким участком гена или другого компонента ДНК, и используется для гибридизации с кДНК или мРНК. Гибридизация зонда и мишени регистрируется и количественно определяется при помощи флюоресценции или хемолюминесценции, что позволяет определять относительное количество нуклеиновой кислоты с заданной последовательностью в образце.

В обычном ДНК микрочипе зонды ковалентно прикрепляются к твердой поверхности - стеклянному или кремниевому чипу. Другие платформы, например, выпускаемые Illumina , используют микроскопические шарики вместо больших твердых поверхностей. ДНК микрочипы отличаются от других микрочипов только тем, что их применяют для измерения ДНК или как часть более сложной системы детекции и анализа ДНК.

ДНК микрочипы используют для анализа изменения экспрессии генов , выявления однонуклеотидных полиморфизмов , генотипирования или повторного секвенирования мутантных геномов . Микрочипы отличаются по конструкции, особенностям работы, точности, эффективности и стоимости.

История

Примечания

Wikimedia Foundation . 2010 .

Смотреть что такое "ДНК-микрочип" в других словарях:

Термин ДНК микрочип Термин на английском DNA microarray Синонимы ДНК чип, DNA chip, Gene сhip, DNA chip Аббревиатуры Связанные термины биосенсор, геном, ДНК, ДНК зонд, лаборатория на чипе, РНК, олигонуклеотид Определение Миниатюрная пластина с… …

Термин ДНК зонд Термин на английском DNA probe Синонимы Аббревиатуры Связанные термины биологические нанообъекты, биомедицинские микроэлектромеханические системы, биосенсор, геном, ДНК, ДНК микрочип, лаборатория на чипе, олигонуклеотид… … Энциклопедический словарь нанотехнологий

Термин ДНК Термин на английском DNA Синонимы дезоксирибонуклеиновая кислота Аббревиатуры ДНК Связанные термины доставка генов, актуатор, бактериофаг, белки, биологические нанообъекты, биомиметика, биомиметические наноматериалы, генная инженерия,… … Энциклопедический словарь нанотехнологий

ДНК-чип

ДНК-биочип - DNA Chip ДНК чип (также: ДНК биочип, ДНК микрочип, ДНК наночип) Специальный чип, используемый для выявления генетических мутаций или сдвигов, диагностики заболеваний. Биочип для американской армии, разработанный специалистами из… … Толковый англо-русский словарь по нанотехнологии. - М.

Микрочип генный м микроматрица - Микрочип, генный м., микроматрица * мікрачып, генны м., мікраматрыца * microarray or gene chip or microchip набор из тысяч уникальных известных однонитевых фрагментов ДНК, иммобилизированных на твердую основу. Эти фрагменты представляют все… … Генетика. Энциклопедический словарь

Сэр Эдвин Мэллор Саузерн (р. 7 июня 1938) английский молекулярный биолог, член лондонского королевского общества по развитию знаний о природе (также известного как лондонское королевское общество), лауреат премии Ласкера (2005). Премия была … Википедия

ДНК микрочип, содержащий комплементарные ДНК. Комплементарная ДНК (кДНК, англ. сDNA) это ДНК, синтезированная из зрелой мРНК в реакции, катализируемой обратной транскриптазой. кДНК ча … Википедия

Количественный анализ нуклеиновых кислот определение концентрации ДНК или РНК в смеси или чистом препарате. Реакции с участием нуклеиновых кислот часто требуют точных сведений о количестве и чистоте препарата. Для определения концентрации… … Википедия

Термин амплификация Термин на английском amplification Синонимы Аббревиатуры Связанные термины Определение (лат. amplificatio усиление, увеличение), в молекулярной биологии увеличение числа копий ДНК. Описание В клетке амплификация происходит в… … Энциклопедический словарь нанотехнологий