Лекарственные средства на основе олигонуклеотидов. Антисмысловые олигонуклеотидные препараты - журнал фармакокинетика и фармакодинамика

Нуклеотимды -- фосфорные эфиры нуклеозидов, нуклеозидфосфаты. Свободные нуклеотиды, в частности АТФ, цАМФ, АДФ, играют важную роль в энергетических и информационных внутриклеточных процессах, а также являются составляющими частями нуклеиновых кислот и многих коферментов.

Соединения, состоящие из двух нуклеотидовых молекул, называются динуклеотидами , из трёх -- тринуклеотидами , из небольшого числа -- олигонуклеотидами , а из многих -- полинуклеотидами , или нуклеиновыми кислотами .

Морфолино (англ. Morpholino ) -- синтетические олигонуклеотиды, применяемые в молекулярной биологии для изменения экспрессии генов. Антисмысловые олигомерные морфолино используются для блокировки доступа других молекул к специфическим последовательностям нуклеиновых кислот. Морфолиновые олигонуклеотиды блокируют небольшие одноцепочечные участки (около 25 нуклеотидов) на поверхности молекул РНК .

Антисмысловые олигонуклеотиды представляют собой длинные последовательности нуклеотидов ДНК в хромосомах. Если какой-то ген должен экспрессироваться, то запускается процесс транскрипции этого гена, в результате которого синтезируется мРНК.

Терапевтический эффект синтетических антисмысловых олигонуклеотидов зависит от спецефичности их гибридизации с доступным сайтом м РНК-мишени, устойчивости к действию клеточных нуклеаз и наличию системы доставки в клетку .

На сегодняшний день наиболее эффективное адресное направленное выключение активности определённых участков генома осуществляется антисмысловыми олигонуклеотидами (АОН). Стратегия использования АОН основана на уотсон-криковском взаимодействии молекул ДНК с М-РНК-мишеныо. Образование гетеродуплекса ДНК-МРНК приводит к инактивации М-РНК и последующей остановке синтеза белка.

Иными словами, под антисмысловым механизмом подразумевается связывание олигонуклеотида с комплементарным участком целевой РНК и подавление внутриклеточной функции данной РНК.

Однако, эта простая и привлекательная теоретическая модель в действительности оказалась значительно сложнее. Известны три типа антисмысловых молекул: относительно короткие синтетические олигонуклеотиды; антисмысловые РНК, экспрессирующиеся в клетке после трансфекции антисмысловым геном рибозимы, обладающие каталитической активностью .

Создание препаратов на основе антисмысловых олигонуклеотидов - одно из новейших направлений лекарственных разработок. Эта технология дает исследователю возможность направленно воздействовать практически на любой процесс в клетке с высочайшей специфичностью. Если какой-то белок способствует росту раковой клетки, то, используя соответствующий антисмысловой олигонуклеотид, можно сделать так, что этот белок больше никогда не будет синтезироваться в клетке. Антисмысловые олигонуклеотиды настолько специфичны, что воздействие на какой-либо другой белок в клетке практически исключено. Такая специфичность обеспечит ослабление побочных эффектов, зачастую наблюдаемых при традиционных способах лечения рака.

Механизм инактивации до сих пор до конца не ясен. Но, возможно, это связано с тем, что двунитевая РНК нехарактерна для нормальных клеток. Так как сигналом для синтеза каждого белка является одна единственная мРНК, то такой сигнал для определенного белка можно выключить или «нокаутировать» с помощью такой комплементарной последовательности .

Рис.4 Механизм работы антисмыслового олигонуклеотида

Важной проблемой лечения препаратами на основе антисмысловых олигонуклеотидов является разрушение таких лекарственных средств ферментами клеток - нуклеазами. Олигодезоксонуклеотиды разрушаются нуклеазами, поэтому очень важно защитить их от действия последних так, что бы они не утратили способности гибридизации с мишенью. Для этого проводят электрофоретическое разделение клеточных белков, в которые включают радиоактивную метку во время трансляции, и с помощью радиоавтографии устанавливают, в присутствии какого из «антисмысловых» олигонуклеотидов снижается синтез определенного белка. Никаких общих критериев выбора наилучших сайтов-мишеней в разных РНК-транскриптах не существует. Эффективными могут оказаться олигонуклеотиды, комплементарные 5"- или З"-конпам мРНК, границам экзонов и интро- нов и даже двухцепочечным областям. Олиго- дезоксинуклеотиды разрушаются внутриклеточными нуклеазами, поэтому важно защитить их от действия последних так, чтобы они не утратили способности к гибридизации с мишенью. Для этого можно модифицировать определенным образом пиримидиновые основания и де- зоксирибозу .

Так, у наиболее широко применяющихся сейчас «антисмысловых» олигонуклеотидов свободный атом кислорода фосфодиэфирной связи заменен на сульфо- группу, в результате чего образуется тиофосфатная связь. Модифицированные таким образом олигонуклеотиды растворяются в воде, несут отрицательный заряд и не расщепляются под действием эндонуклеаз. При гибридизации с сайтом-мишенью они образуют РНК--ДНК-дуплексы, которые активируют ри- бонуклеазу (РНКазу) Н, эндогенный фермент, расщепляющий мРНК в гибридной молекуле. Проведены первые клинические испытания таких олигонуклеотидов -- лекарственных средств «первого поколения». Мишенями являются РНК цитомегаловируса, вируса иммунодефицита человека, а также мРНК генов, ответственных за развитие рака, болезней кишечника и других заболеваний .

Синтезированы «антисмысловые» олигонуклеотиды с фосфорамидитной и полиамидной (пептидной) связями. Такие молекулы очень устойчивы к действию нуклеаз. Химические группы, присоединенные к 2"-угле- родному атому сахарного остатка и С-5-атому пиримидинов, также защищают «антисмысловые» олигонуклеотиды и облегчают их связывание с сайтом-мишенью). Все преимущества этих и других модификаций сейчас интенсивно изучаются.

Введение

Разработка лекарственных препаратов направленного действия является приоритетной задачей современных молекулярной биологии, биоорганической химии и медицины. В настоящее время существует большое количество работ, отражающих различные подходы для решения этой задачи. По ряду причин наиболее перспективным является подход, основанный на выборе в качестве мишени мРНК патогенного белка и использование свойства комплементарности при взаимодействии нуклеиновых кислот друг с другом. На сегодняшний день работы ведутся в трёх направлениях:

Антисмысловые олигонуклеотиды;

Рибозимы и ДНКзимы;

SiRNA и miRNA.

В основе этих методов лежит использование коротких молекул нуклеиновых кислот (17 - 70 н.) с последовательностью, частично или полностью комплементарной участку мРНК - мишени. Общие принципы действия таких агентов объединяют их и в области возникающих проблем, среди которых наиболее острыми являются доставка в клетку, устойчивость к действию нуклеаз и эффективность взаимодействия с мРНК-мишенью. Химические модификации НК-агентов помогают частично или полностью решить многие из этих проблем и повысить эффективность действия агентов.

Изучение механизмов подавления экспрессии гена, используя комплиментарные взаимодействия требует использования методов анализа, позволяющих однозначно определить антисмысловое действие олигонуклеотидов.

Целью настоящей работы является отработка метода подавления экспрессии гена EGFP в клетках с использованием конъюгатов олигонуклеотида с пиреном.

Модификации антисмысловых олигонуклеотидов (Литературный обзор)

Разработка лекарственных препаратов, позволяющих на уровне гена предотвращать развитие заболеваний, вызванных экспрессией патогенных белков (вирусные, продукты онкогенов) или белков, препятствующих его излечению (MDR), привела к появлению и развитию антисенс-технологии. Принцип антисенс-технологии просто: антисмысловые олигорибонуклеотиды вызывают подавление экспрессии гена-мишени сиквенс-специфическим образом, используя способность олигонуклеотидов гибридизоваться с мРНК-мишенью посредством Уотсон-Криковских взаимодействий. Олигонуклеотид, связываясь с РНК-мишенью, препятствует её дальнейшему процессингу . Эксперименты на клеточных культурах показали, что использование олигодезоксирибонуклеотидов (далее ODN) длиной 20 - 30 н., комплиментарных участку мРНК значительно снижает уровень экспрессии кодируемого ею белка. Развитие метода показало ряд причин, приводящих к снижению эффективности ODN: короткое время жизни ODN в сыворотке, низкая эффективность проникновения (транспорта) в клетку и недостаточная эффективность связывания со структурированными фрагментами РНК.

Развитие органической химии, в частности, химии нуклеиновых кислот, позволяет искать пути решения возникающих проблем внесением различных химических модификаций ODN. Химической модификации могут подвергаться как азотистые основания, так и сахаро-фосфатный остов, что приводит к повышению его нуклеазоустойчивости ODN и эффективности его связывания с комплементарной последовательностью. Повышение эффективности доставки ODN в клетку пытаются решить введением в его состав по одному из концов различных групп, облегчающих прохождение через мембрану .

В основном выделяют два механизма действия антисмысловых олигонуклеотидов: арест трансляции за счёт связывания регуляторной области и расщепление РНК в составе РНК-ДНК-гетеродуплекса. Ведение модификаций может оказывать различное влияние по тому или другому механизму, что следует учитывать при выборе варианта модификации .

1.1 Механизм действия антисмысловых олигонуклеотидов

При взаимодействии антисмыслового олигонуклеотида с мРНК происходят два события: стерическое блокирование и расщепление мРНК-мишени РНКазой H. Для одних олигонуклеотидов происходят оба события (РНКаза H-компетентные олигонуклеотиды), для других - только стерическое блокирование (РНКаза H-независимые). Эти два варианта основаны на различных клеточных механизмах. Наиболее широкий спектр молекулярных механизмов затрачивается при использовании второго варианта. Это достигается адресацией олигонуклеотидов к определённым регуляторным последовательностям, как в пре-мРНК, так и в мРНК. В случае пре-мРНК адресация ODN к граничной области между интроном и экзоном нарушает сплайсинг, что приводит либо к его остановке, либо к образованию мРНК, кодирующей нефункциональный белок (см. рис.1). Другим перспективным участком связывания ODN в пре-мРНК является 5"-концевой регион. Взаимодействие ODN с этим регионом приводит к блокированию кепирования .

При взаимодействии ODN с мРНК происходит нарушение её трансляции, а следовательно и синтеза белка за счёт блокирования движения рибосомы по мРНК или даже её сборки в зависимости от положения сайта связывания .

Рис.1.

РНКаза H-компетентные ODN могут быть адресованы к любому участку пре-мРНК и мРНК, так как их действие основано на активации РНКазы H, субстратом которой является РНК в составе дуплексов РНК - ДНК. Однако многие химически модифицированные антисмысловые олигонуклеотиды неспособны включать этот механизм ввиду высокой стерической специфичности РНКазы H. Это связано с тем, что большинство модификаций приводит к изменению параметров спирали дуплекса ODN - РНК, и они перестают быть субстратами для РНКазы H.

Антисмысловые олигонуклеотиды второго поколения - модифицированные по 2"-положению остатка сахара, не являются субстратами РНКазы Н, поэтому нужно искать другие расщепляющие агенты (искусственные РНКазы). Ряд малых молекул (интеркаляторы, поликатионы) способны расщеплять РНК-мишень. Прикрепление к олигонуклеотидам реакционноспособных групп приводит к расщеплению желаемых участков РНК-мишени. Такие группы - это комплексы металлов, амины, олигопептиды и молекулярные конструкциями с группами активного центра нуклеаз (имидазольное кольцо, COO - -, NH 2 -группы, гуанидин) .

1.2 Модификации антисмысловых олигонуклеотидов

1.2.1 Стратегии развития химических модификаций олигонуклеотидов

На основе накопленных данных по применению антисмысловых олигонуклеотидов был сформулирован ряд критериев, которым должен удовлетворять ODN, чтобы быть эффективным терапевтическим агентом :

· устойчивость к нуклеазам

· высокая аффинность к мишени

· формирование субстрата РНКазы H

· различные механизмы действия (влияние альтернативный сплайсинг, арест трансляции)

· нетоксичность и специфичность

· возможность неспецифического связывания с белками для транспорта

· лёгкость синтеза, патентабельность, выгода

Нативные ODN не способны полностью удовлетворять всем перечисленным критериям. Основными ограничениями выступают слабая нуклеазная устойчивость и недостаточно стабильные комплексы ODN - РНК. Введение химических модификаций в ODN по всем или отдельно взятым нуклеотидам позволяют в значительной степени устранить имеющиеся недостатки. Модификации ODN проводят по фосфатной группе, остатку сахарозы, азотистому основанию или по концевым фосфатным остаткам. Для повышения нуклеазной устойчивости чаще всего проводят модификацию по фосфатной группе и остатку дезоксирибозы . Повышение эффективности связывания получают за счёт модификации азотистых оснований , а также остатка дезоксирибозы . Для повышения эффективности связывания с белками и улучшения транспорта производят конъюгацию с лигандами различной природы . В ряде случаев присоединённые химические конструкции выполняют роль катализаторов фосфодиэфирных связей в РНК .

1.2.2 Модификации фосфатной группы

Расщепление нуклеазами фосфодиэфирных связей в ДНК происходит через эффективное связывание в активном центре и с использованием кислотно-основных свойств фосфатной группы. Один из способов повысить устойчивость связей ODN к действию нуклеаз - изменить электронную конфигурацию фосфатной группы. Для этого один из несвязанных атомов кислорода заменяют атомом другого элемента. Одним из первых в качестве такого элемента использовали серу, в результате чего были получены фосфоротиоаты (модифицированные антисмысловые олигонуклеотиды первого поколения; см. рис. 2, II).

Рис. 2.

Фосфоротиоаты проявили высокую устойчивость к действию нуклеаз, однако такая модификация значительно повысила токсичность ODN .

Заменой несвязанного атома кислорода фосфатной группы метильной группой получают метилфосфонаты (см. рис. 3, III), проявляющие высокую устойчивость к действию нуклеаз. Модификацию часто проводят только по концевым нуклеотидам, что приводит к уменьшению токсичности .

Если заменить атом кислорода фосфата остатком BH 3 - , получаются боранофосфаты. Остаток -BH 3 - изоэлектронен атому кислорода в фосфодиэфирных связях, за счёт чего боранофосфаты сохраняют свой отрицательный заряд, хорошо растворимы в воде и формируют комплексы с РНК-мишенью. Также этот остаток изоэлектронен и изостеричен метильной группе, благодаря чему от них следует ожидать свойства, аналогичные свойствам метилфосфонатов, такие как устойчивость к нуклеазам .

Рис. 3.

1.2.3 Модификации остатка сахара

Модификации фосфодиэфирных связей не оказывают значительного эффекта на стабильность гетеродуплекса ДНК - РНК. Поэтому, кроме модифицированных олигодезоксинуклеотидов, представляют интерес так называемые модифицированные антисмысловые олигонуклеотиды второго поколения - это замещённые по 2"-гидроксильной группе остатка рибозы олигорибонуклеотиды. Такая модификации также повышает устойчивость к действию нуклеаз. Хотя РНК значительно менее устойчивы к воздействию окружающей среды по сравнению с ДНК за счёт наличия 2"-OH-группы, именно модификации по этой группе позволяют получить стабильные продукты, проявляющие меньшую токсичность по сравнению с фосфонатами. Также к модифицированным антисмысловым олигонуклеотидам второго поколения часто относят и олигонуклеотиды с модифицированным остовом не сахарофосфатной природы, например, пептидные нуклеиновые кислоты, также проявляющие нуклеазоустойчивость и образование термодинамически стабильных гибридов с молекулами мРНК-мишени.

Рис.4. Модификации второго поколения: V - 2"-O-алкил-РНК, VI - LNA, VII - Morpholino, VIII - PNA.

Анализ данных по использованию ряда 2"-O-алкильных производных РНК, содержащих от одного до пяти метиленовых звеньев в алкильном радикале, показал, что с увеличением количества метиленовых звеньев возрастает устойчивость модифицированного олигонуклеотида к действию нуклеаз (пентокси > пропокси > метокси > дезокси). Эта зависимость может объясняться стерической недоступностью нуклеотида при присоединении более объемного заместителя. Однако, стерические затруднения, вызванные наличием объёмных заместителей, снижают эффективность образования комплементарных комплексов с мРНК-мишенью, поэтому наибольшего сродства к мишени достигли при использовании малых заместителей . При сравнении физико-химических параметров 2"-O-метилированных фосфоротиоатов (Me-S-ODN), S-DNA и немодифицированной ДНК выяснилось, что температура плавления (T m) гетеродуплексов ДНК - РНК возрастает в следующем порядке: Me-S-ODN - RNA > normal DNA - RNA > S-ODN - RNA . Недостаток данной модификации состоит в том, что РНКаза H не может расщепить мРНК-мишень в РНК - РНК-комплексе. Как следствие этого недостатка, такие олигонуклеотиды являются менее мощными ингибиторами экспрессии генов по сравнению с немодифицированными .

2"-катионные модификации приводят к образованию цвиттер-ионных олигонуклеотидов. Такие олигонуклеотиды, кроме образования более стабильных гетеродуплексов, по сравнению с немодифицированными, обладают большей способностью проникать через биологические мембраны и высокую стабильность к действию нуклеаз вследствие своего заряда. 2?-O-этил]олигонуклеотиды (2"-O-DMAEOE, см. рис 5), благодаря эффекту заряда, образуют гетеродуплексы с РНК-мишенью с температурой плавления на 2 єС больше по сравнению с немодифицированными олигонуклеотидами . Цвиттер-ионные олигонуклеотиды сохраняют РНКаза H-компетентность, если модификации разбросаны по всей длине олигонуклеотида.

Рис. 5. 2"-O-DMAEOE

Конформационно ограниченные «блокированные» нуклеиновые кислоты (Locked Nucleic Acids, LNA) - модифицированные нуклеиновые кислоты, имеющие как минимум один мономер с бициклической фуранозой в качестве сахарного остатка (см. рис. 4, VI). Они обладают большим сродством к комплементарной последовательности (температура плавления дуплекса возрастает на 6 °С при модификации одного нуклеотида ), что является и достоинством (эффективное связывание мишени), и недостатком (образование шпилек). Такое сродство необходимо учитывать при конструировании LNA . Исследования на мышах показали малотоксичность LNA .

Пептидные нуклеиновые кислоты (PNA) - аналоги нуклеиновых кислот, в которых сахарофосфатный остов заменён на псевдопептидный N-(2-аминоэтил)-глициновый полимер. N-конец иминирует 3"-конец олигонуклеотида, а C-конец - его 5"-конец (см. рис. 3, VII). Комплексы PNA - РНК более стабильны, чем комплексы ДНК - ДНК и РНК - РНК. Несмотря на то, что PNA могут связывать мишень как в антипараллельной (по Уотсону - Крику), так и в параллельной (по Хугстину) ориентации, более стабильные комплексы образуются при антипараллельной ориентации PNA. Исследования показали малую токсичность PNA .

Морфолины (см. рис. 3, VIII) - это реагенты, совмещающие стабильность, резистентность к действию нуклеаз, эффективность, активность в течение долгого периода, водорастворимость, высокую специфичность и низкую токсичность. Молекулы имеют нейтральный заряд . Производством морфолинов занимается компания Gene Tools, LLC (http://www.gene-tools.com ).

Для сохранения РНКаза H-компетентности необходимо, чтобы в середине олигонуклеотида был участок хотя бы из 7 дезоксинуклеотидов, поэтому используются «смешанные» антисмысловые олигонуклеотиды, т.е. имеющие разные модификации в разных звеньях (LNA/DNA, LNA/RNA и т.п.). Также в реакционную смесь добавляют соединения, содержащие группы, вызывающие расщепление мРНК-мишени за счёт сходства с активным центром РНКазы H, либо модифицировать не все нуклеотидные звенья (например, только 3"- и 5"-концы). .

Таким образом, основные свойства модифицированных по сахарофосфатному остову антисмысловых олигонуклеотидов можно суммировать в следующей таблице:

Таблица 1. Сравнение модификаций сахарофосфатногого остова.

Модификация	Стабильность к нуклеазам	Сродство к мишени	Активация РНКазы H	Нетоксичность

1.2.4 Модификации азотистых оснований

Эффективного антисмыслового действия бывает трудно достичь только за счёт модификаций сахарофосфатного остова. Модифицированные азотистые основания повышают эффективность действия антисмысловых ODN за счёт увеличения сродства к РНК-мишени (аминоаденозин, G-clamp) и скорости проникновения через плазматическую мембрану (катионные и цвиттер-ионные группы).

При присоединении феноксазина к остатку цитозина получается так называемый G-clamp (см. рис. 6, X), образующий дополнительную водородную связь с остатком гуанина, благодаря чему на 6 - 18 °С увеличивается температура плавления гибрида ODN - РНК. Такая модификация производится обычно по 3"-концу, что не нарушает РНКаза H-компетентность .

При введении аминогруппы в остаток аденина(см. рис. 6, XI) также возрастает сродство к мишени за счёт образования дополнительной водородной связи с остатком тимина .

Рис. 6. Дополнительные водородные связи между С и G clamp (X), между T и A NH2 (XI)

ODN с присоединёнными к остаткам азотистых оснований катионными и цвиттер-ионными группами (например, спермидиновой, рис. 7) за счёт своего положительного заряда не только обладают бьльшим сродством к мишени, но и улучшенной способности к проникновению в клетку и стабильностью к действию нуклеаз .

Рис. 7.

С концевыми азотистыми основаниями для визуализации места расположения ODN в клетке конъюгируют большие флуоресцирующие лиганды, такие как флуоресцеин .

Рис.8.

1.2.5 Присоединение объёмных заместителей

Способность проникать внутрь клетки, минуя клеточную мембрану, - одно из качеств, которое должно присутствовать у эффективного антисмыслового олигонуклеотида. Большинство описанных выше модификаций нуклеотидов в составе ODN не оказывают значительного влияния на транспорт ODN через клеточную мембрану. Существует несколько путей проникновения молекул через плазмалемму, но для ODN важны два: диффузный, или не рецептор-опосредованный, и рецептор-опосредованный. Транспорт по первому варианту затрудняется суммарным отрицательным зарядом ODN и их гидрофильностью. Использование второго пути ограничено недостаточными данными о поверхностных белках мембраны клеток, отвечающих за транспорт нуклеиновых кислот в клетку. Создание конъюгатов ODN с различными химическими группами способствует повышению эффективности транспорта по тому или иному пути в зависимости от типа химической группы и места её присоединения к ODN. На рисунке 9 представлены варианты линкеров, которые используются при получении конъюгатов. Лиганды можно присоединять к азотистым основаниям, концевым фосфатам, фосфодиэфирным (или аналогичным им) связям, а также остаткам сахара. Некоторые типы химических групп позволяют также визуализировать компартментализацию путём детекции флуоресценции. модификация олигонуклеотид антисмысловый реакция

Рис.9.

Частичная и даже полная нейтрализация отрицательного заряда ODN не оказывает существенного эффекта на способность ODN к самопроизвольному транспорту в клетку. Присоединение различных объёмных гидрофобных лигандов, в частности, тех, что изображены на рисунке 9, облегчает транспорт ODN через мембрану.

Рис.10.

Хорошо изучены конъюгаты с холестеролом . Механизм, улучшающий проникновение в клетку за счёт присоединения холестерола, ещё не до конца ясен, хотя, предполагается рецептор-опосредованное включение липопротеидов . Холестероловые конъюгаты образуют мицеллы, что облегчает их транспорт внутрь клетки. Присоединяют остаток холестерола обычно по концевым 5"- и 3"-фосфатам, причём 3"-монохолестерилолигонуклеотиды более эффективны по сравнению с 5"-монохолестерилолигонуклеотиды, а самыми действенными являются 5",3"-бисхолестерилолигонуклеотиды. К примеру, через 6 мин после инъекции в кровь мыши уровень в тканях 3"-мономодифицированных фосфоротиоатиов был в 4 раза, а 5"-моно- и 3",5"-бисмодифицированных - в 7 раз выше по сравнению с немодифицированными фосфоротиоатами .

Используют мономеры с 5"- или/и 3"-холестерилзамещённым фосфатом , олигонуклеотиды с лигандом, конъюгированным с фосфодиэфирной связью перед 3"-концевым нуклеозидом , а также холестериловые дендримеры с остатком лизина в качестве линкера (см. рис. 11) .

Рис.11.

Олигонуклеотиды, конъюгированные с другими гидрофобными молекулами (адамантан, пирен, эйкозановая кислота и др.), были синтезированы и сравнены с холестероловыми. Холестероловые конъюгаты показали оптимальную липофильность, а также хорошую способность к аккумуляции в печени .

Конъюгация с производными пирена, кроме улучшения способности к транспорту, представляет интерес по причине их способности к флюоресценции. Бис-пиренильные производные способны образовывать эксимеры - бимолекулярные комплексы, в которых одна молекула находится в основном состоянии, другая - в возбуждённым. Такие комплексы очень чувствительны к пространственному окружению, по уровню флуоресценции можно судить о том, находится ODN в связанном с РНК-мишенью состоянии или нет :

Рис.12.

Для улучшения эффективности транспорта в клетку используются также пептидные конъюганты. К олигонуклеотидам, в т.ч. PNA, присоединяют пептид, способный переносить через мембрану большие полярные заряженные молекулы . Так, пептид Antennapedia имеет сайты связывания ДНК. PNA с присоединённым пептидом Antennapedia не только эффективно проникает в клетку, но и мигрирует в ядро .

Рис.13.

Присоединение к концам молекул антисмысловых ODN больших плоских интеркалирующих молекул, таких, как акридин (см. рис. 14), представляет интерес в качестве увеличителя эффективности расщепления молекулы РНК-мишени. За счёт интеркаляции локально разрыхляется взаимодействие ODN - РНК. В следствие увеличения расстояния между ДНК и РНК за счёт размеров молекулы интеркалятора образуется «выпетливание» молекулы РНК из двойной спирали гетеродуплекса. Катионы тяжёлых металлов, например Lu 3+ , координированные с атомами азота остатка акридина, катализируют гидролиз РНК без участия РНКазы H, а «выпетливание» как дестабилизирующая структура ускоряет этот процесс .

Рис. 14.

1.3 Физико-химические аспекты взаимодействия олигонуклеотида и РНК-мишени

Эффективность действия антисмысловых олигонуклеотидов количественно характеризуется сродством ODN к мРНК-мишени и эффективной константой расщепления последней.

Сродство ODN к адресуемой ему РНК (или свободная энергия образования гетеродуплекса) описывает стабильность гибрида ДНК - РНК. r G может быть измерена калориметрически , либо рассчитана теоретически . При расчете свободной энергии Гиббса образования гетеродуплекса используется закон Гесса (свободная энергия Гиббса сложной реакции не зависит от её пути) и расчеты энергий образования вторичных и третичных структур по правилу «ближайшего соседа» (nearest neighbor rule) с помощью программы mfold, разработанной Цукером и соавторами. Реакцию можно представить следующим образом:

В этой схеме М, O, H - соответственно мРНК-мишень, антисмысловой ODN и гетеродуплекс ODN - РНК с учётом их вторичной и третичной структуры, М u , O u , H u - соответственно мРНК-мишень, антисмысловой ODN и гетеродуплекс ODN - РНК без учёта их вторичной и третичной структуры, un G (M) , un G (O) , un G (H) - свободные энергии Гиббса укладки их во вторичную и третичную структуру, r G, r G (unfolded) - свободные энергии гибридизации ODN и мРНК в свёрнутом и полностью денатурированном состоянии соответственно.

un G (M) , un G (O) , un G (H) и r G (unfolded) могут быть теоретически рассчитаны. Тогда свободная энергия гибридизации находится по закону Гесса:

Константу равновесия процесса ассощиации гетеродуплекса K 1 можно найти, исходя из рассчитанной свободной энергии Гиббса процесса гибридизации:

Для оценки температуры плавления гетеродуплекса также пользуются правилом «ближайшего соседа» и рассчитывают её с помощью соответствующих программ.

Экспериментально можно найти эффективную константу скорости k eff брутто-реакции превращения мРНК M в условный продукт X (эта условность не влияет на результат кинетических расчетов, но значительно их упрощает):

Эффективная константа скорости брутто-реакции показывает наблюдаемую скорость расщепления мРНК-мишени.

Механизм реакции можно представить следующей схемой:

В этой схеме E - фермент РНКаза H, HE - промежуточный комплекс её с субстратом H, K 1 - константа ассоциации гетеродуплекса, рассчитываемая по формуле (3).

Для данной кинетической схемы можно составить систему кинетических уравнений:

где С A - концентрация вещества A, k i - константа скорости i-й элементарной реакции.

Обычно измеряемым параметром является концентрация мРНК в растворе (исходная C M0 и текущая C M ), поэтому k eff считают относительно к матрице:

Использовав квазистационарное приближение по промежуточному продукту HE и упростив выражение для скорости реакции w с помощью уравнения Михаэлиса - Ментен:

где - константа Михаэиса, можно преобразовать выражение для скорости изменения концентрации гетеродуплекса H:

Найдём выражение для эффективной константы скорости расщепления мРНК-мишени в двух случаях: когда процесс лимитируется связыванием мРНК антисмысловым ODN и лимитируется каталитическим расщеплением мРНК-мишени в составе гетеродуплекса.

Случай 1. Лимитирование гибридизацией.

В этом случае процесс расщепления идёт значительно быстрей, чем гибридизация. Поэтому можно допустить предположение об установлении стационарной концентрации гетеродуплекса H, т.е.:

С другой стороны, легко увидеть (6), что:

То есть, в данном случае выражение для скорости расщепления мРНК совпадает по абсолютному значению с выражением скорости реакции (скорости образования условного продукта Х). Воспользовавшись этим, преобразуем выражение для скорости изменения концентрации олигонуклеотида, мы увидим, что его концентрацию можно считать практически неизменной:

Воспользовавшись выражением (14) и, как следствие, пренебрегая вкладом члена k -1 С H в находим скорость расщепления мРНК в новом виде и выражаем k eff .

Случай 2. Лимитирование каталитическим расщеплением субстрата.

В случае, когда расщепление идёт значительно медленнее образования гетеродуплекса, можно считать, что успевает установиться равновесие.

Равновесной концентрацией гетеродуплекса можно пренебречь по сравнению с константой Михаэлиса в выражении скорости:

Записав выражение константы равновесия K 1 и уравнения материального баланса для М и О, получаем достаточно условий для решения уравнения:

где [ A ] - равновесная концентрация, С А 0 - исходная концентрация вещества.

С учётом (17) и (18), получаем выражения равновесных концентраций H и O:

Подставляя (21) в уравнение Михаэлиса - Ментен (16), получаем модифицированное уравнение скорости реакции:

Подставляя выражения (20), (21) и (22) в (12) и опуская громоздкие промежуточные расчеты, получаем выражение для скорости каталитического расщепления мРНК:

откуда нетрудно найти формулу эффективной константы скорости брутто-процесса:

На пути создания лекарств на основе антисмысловых ODN лежит множество преград: слабая способность к интернализации, неустойчивость к нуклеазам, токсичность и другие. Химические модификации способны устранить многие из этих проблем, но лишь частично, и трудно найти компромисс между достоинствами и недостатками какой-либо модификации. Несмотря на это, многие препараты на основе ODN прошли испытания. Первое лекарство на основе ODN - Vitravene, направленное на борьбу с цитомегаловирусной инфекции у больных СПИДом .

Резюме

В обзоре рассмотрены фармакокинетические особенности различных антисмысловых олигонуклеотидных препаратов. Проведено сравнение фармакокинетики препаратов первого и второго поколения. А так же рассмотрено влияние на фармакокинетику химической модификации молекулы.

Ключевые слова : антисмысловые олигонуклеотиды, фосфотиоатные олигодеоксинуклеотиды, фармакокинетика

Введение

Фармакокинетические свойства антисмысловых олигонуклеотидов (АСО) становятся наиболее понятными при рассмотрении их физических и химических свойств. Такие параметры как заряд, молекулярная масса и амфипатическая природа фосфотиоатных АСО оказывают заметное влияние на их фармакокинетику. Особенно значимое влияние на фармакокинетические свойства АСО оказывает химическая структура, в частности фосфотиоатная группа и 2"-метоксиэтил (МОЭ).

Всасывание, распределение, метаболизм, и выведение фосфотиоатных олигодеоксинуклеотидов (ОДН) первого поколения были тщательно изучены на лабораторных животных и в клинических исследованиях . Особенности фармакокинетики препаратов фосфотиоатных АСО заключаются в следующем: введённые парентерально фосфотиоатные ОДН быстро оказываются в плазме крови, где они связываются с гидрофильными участками белков плазмы и таким образом избегают гломерулярной фильтрации. Эти гидрофильные участки отличны от других гидрофильных участков, с которыми связываются липофильные препараты, и, таким образом, конкуренция за связывание с белками плазмы для АСО невелика. Кинетика в плазме характеризуется короткой фазой распределения (порядка нескольких часов), а затем наступает фаза выведения препарата с периодом его полувыведения, составляющим дни или недели. Начальная фаза распределения обязательно включает связывание АСО с белками и распределение этих комплексов по тканям печени, почек, лимфатических узлов, костного мозга и селезёнки, которые являются местами наиболее активного связывания и накопления АСО. Совершенно очевидно, что фаза выведения АСО вследствие начального связывания с белками, определяется начальным этапом его распределения. Вследствие возможного насыщения белков, площадь под фармакокинетической кривой (AUC) увеличивается с увеличением дозы, так как АСО уже не связываются с белками после их насыщения, а попадают в свободном виде в кровоток. После связывания АСО попадают в клетки по градиенту концентрации из внеклеточного пространства через клеточную мембрану во внутриклеточное пространство, вероятно, с помощью белка-переносчика. АСО в клетках связываются с доступными мишенями, но главным образом АСО в клетках, вероятнее всего, связываются с внутриклеточными белками. В клетке убиквитарные нуклеазы, но не ферменты цитохрома P450, метаболизируют препараты АСО. Поскольку ферменты цитохрома P450 обычно метаболизируют низкомолекулярные препараты, АСО не конкурируют в метаболических процессах с обычными низкомолекулярными соединениями, снижая риск развития лекарственных взаимодействий. Выведение АСО с мочой в конечном счёте является результатом метаболизма в тканях и установления равновесия метаболитов и нативного вещества вне тканей и в системном кровотоке. Эти процессы у лабораторных животных и человека очень сходны, в силу чего не удаётся выявить межвидовую корреляцию между лабораторными животными и человеком.

В настоящее время конфигурация «второго поколения» АСО, чьей особенностью являются МОЭ группы в положении 2"- нуклеотидов на 3"- и 5"-концах наиболее широко используется в клинических исследованиях. Эта конфигурация представляет собой более совершенную структуру по сравнению с немодифицированными фосфотиоатными ОДН, являющимися антисмысловыми препаратами первого поколения. Это обусловлено её повышенной эффективностью, уменьшенной токсичностью и повышенным периодом полувыведения. Многие факторы, связанные с переходом от первого ко второму поколению АСО, имеют непосредственное отношение к улучшению их фармакокинетики.

Особенности химического строения АСО

Фосфотиоатный скелет

Самые ранние попытки создать препараты с антисмысловой активностью были связаны с использованием немодифицированной ДНК, которая, к сожалению, была очень восприимчива к разрушению нуклеазой. Как оказалось, убиквитарные нуклеазы расщепляют фосфодиэстеразные связи нативной ДНК, в результате чего период полувыведения немодифицированных АСО составлял минуты. Такая быстрая деградация была основной особенностью фармакокинетического профиля немодифицированных антисмысловых ДНК. Изменение фосфодиэфирного скелета ДНК на фосфотиоатный резко изменило фармакокинетический профиль АСО. В этих препаратах фосфотиоатная структура заменяет в фосфодиэфирных связях один атом серы на один немостиковый атом кислорода. Такая структура повышает устойчивость АСО к нуклеазам и, как следствие, улучшает их кинетические свойства.

Фосфотиоатная хиральность

Как показали исследования, тиатион диэфирного скелета АСО не только повышает его устойчивость к нуклеазам, но и способствует возникновению хиральности, то есть возможности существования стереоизомеров, по каждой фосфотиоатной связи, что приводит к тому, что в любой 20-mer АСО существуют 219 Sp или Rp стереоизомеров . Комбинация резистентности к нуклеазам и повышение связывания с белками сильно влияет на фармакокинетику АСО. Повышение стабильности фосфотиоатных АСО приводит к тому, что период полувыведения препарата из плазмы увеличивается до 30-60 минут в сравнении с периодом полувыведения фосфодиэфирных АСО, составляющим 1-2 минуты.

Устойчивость к нуклеазам и хиральность из-за замены фосфодиэфирных на фосфотиоатные связи заслуживают обсуждения, потому что физические свойства связанные с этой структурной особенностью важны как для первого-, так и для второго поколений АСО. Устойчивость к нуклеазам фосфотиоатных АСО возникает из-за близости серы на немостиковом кислороде в активном участке экзонуклеазы к иону металла. Эта близость может вызывать смещение иона металла из активного участка. Данный эффект был продемонстрирован на модели 3"–5" экзонуклеазы ДНК-полимеразы. Рентгеновские кристаллографические данные подтверждают эту гипотезу о смещении иона металла. Очевидные различия в чувствительности стереоизомеров к экзонуклеазной активности ДНК-полимеразы согласуются с предложенной конформацией фосфотиоатных стереоизомеров ОДН в активном участке. Вполне вероятно, что хиральность фосфоротиоатных связей может помешать другим нуклеазам таким же образом, то есть смещением иона металла, хотя различные экзонуклеазы могут показать различные предпочтения связей Rp и Sp в зависимости от природы активного центра фермента.

В альтернативе, сера может просто занимать место кислорода в диэфирных связях. Различия в способности серы брать на себя отрицательный заряд, по сравнению с кислородом, позволяют прогнозировать изменения активного центра. Это изменение, скорее всего, происходит из-за гидролиза фосфодиэфирных связей, и может осуществляться через формирование переходного пятивалентного фосфора с двумя отрицательно заряженными атомами кислорода. Замена одного из экваториальных атомов кислорода серой будет иметь отрицательные последствия на активность ферментов: (1) снижается связывание воды, которая стабилизирует местный отрицательный заряд на атомах, что приводит к трудностям для получения второго отрицательного заряда серы; и (2) снижение связывания Mg 2+ с серой. Существует доказательство для последнего эффекта в исследованиях уровня расщепления рибозимами диастереомерных фосфотиоатных включений, когда добавление Mg 2+ ингибирует расщепляющие эффекты фосфоротиоатных рибозимов . Кроме того, было показано, что существует некоторое снижение активности нуклеаз на участках скелета, находящихся дальше от фосфотиоатных связей, что даёт возможность предположить передачу эффекта хиральности . Этот феномен лучше всего объясняется изменениями в расположении молекул воды вокруг фосфотиоатного скелета по сравнению с фосфодиэфирным .

Стереоспецифические воздействия на активность нуклеаз заметно влияют на фармакокинетику фосфоротиоатных АСО и это наиболее наглядно проявляется в скорости метаболизма фосфоротиоатных АСО первого поколения в плазме крови. Скорость полного выведения АСО из плазмы уменьшается, предполагая замедление метаболизма. Эти изменения в скорости не могут быть объяснены исходя только из кинетики первого порядка, но их можно объяснить различиями в восприимчивости связей Rp и Sp.

Стереоспецифические различия в экзонуклеазной активности для АСО второго поколения менее важны. Это обусловлено тем, что АСО второго поколения имеют 2"-модификации на 3"- и 5"-концах, которые предотвращают их расщепление экзонуклеазой. С помощью эндонуклеазы, выделенной из возбудителя Serratia marcescens, были изучены эффекты хиральности фосфоротиоатнных связей . Сайт воздействия эндонуклеазы так же, как экзонуклеазы – это один из немостиковых кислородов для гидролиза фосфодиэфирных связей. В диастереомере сера локализуется в непосредственной близости от Mg 2+ , вследствие чего уменьшается активность фермента, в то время как в диастереомере Rp – нет. Поскольку эндонуклеаза Serratia имеет значительные сходства с некоторыми эндонуклеазами млекопитающих, следует предположить, что этот механизм может быть широко применим. Каким образом стереохимические особенности фосфоротиоатных связей влияют на действие других эндонуклеаз – не известно. Однако если предположить, что реакция развивается по схеме, аналогичной эндонуклеазе Serratia, можно думать, что активный участок будет содержать ион металла (вероятно, Mg 2+) и сера будет влиять на действие нуклеаз, когда она будет ориентирована на ион металла. Если эндонуклеазы чувствительны к хиральности, это могло бы иметь важные последствия для развития проблемы создания эффективных препаратов второго поколения. Как и влияние хиральности на препараты первого поколения, так и хиральное воздействие на метаболизм препаратов второго поколения может привести к замедлению их метаболизма. Так, например, можно предположить, что быстро метаболизирующиеся стереоизомеры будут выборочно разрушаться, оставляя функционирующими только медленно метаболизирующиеся изомеры.

Связывание АСО с белками

Было установлено, что в сравнении с АСО с фосфодиэфирным скелетом, на фармакокинетику фосфотиоатных структур оказывает существенное влияние их связывание с белками. Химической основой повышения связывания с белками является повышенная липофильность фосфотиоатных связей по сравнению с фосфодиэфирными. Поскольку молекулярные взаимодействия с водой определяются формой и функцией макромолекул в водном растворе , то даже небольшие изменения в липофильности скелета по всей длине АСО могут иметь последствия для взаимодействия олигомера с водой и макромолекулами, такими как белки.

В первом приближении, фосфотиоатные ОДН связываются с клеточными белками более беспорядочно, чем фосфодиэфирные ОДН . Почему фосфотиоатные АСО лучше связываются с белками до конца не выяснено. Возможные объяснения предполагают повышение липофильности и комплексообразование с ионами металлов.

Важность связывания с белками плазмы для фармакологии, фармакокинетики и токсикологии фосфотиоатных АСО (как первого, так и второго поколений) сложно переоценить. На микромолярном уровне концентраций более чем 90% фосфотиоатных ОДН связываются в плазме. Есть особые отличия в проценте и силе связывания с белками, так же как качественные отличия в связывании АСО с особыми белками у разных видов. Связывание фосфотиоатных АСО с циркулирующими белками удерживает эти соединения от фильтрации в почечных клубочках и выведения с мочой. В случае насыщения, например при введении большой дозы АСО, выведение с мочой АСО полной длины усиливается. Вследствие видовых различий, насыщение у различных видов определяется разными концентрациями АСО. Например, белки плазмы мышей имеют меньшее сродство к АСО, по сравнению с таковыми крыс или человека. Поэтому эффект насыщения процесса связывания АСО с белками плазмы у мышей происходит при более низких концентрациях, по сравнению с другими видами. Видовые различия в связывании плазмы с белками являются существенным фактором отличия в межвидовой фармакокинетике.

Устойчивость к нуклеазам и связывание с белками, которые характерны для АСО с фосфотиоатными связями, изменяют и фармакокинетику терапии с применением АСО. Дополнительные химические структуры, характерные для второго поколения создаваемых препаратов, вносят и другие изменения в их фармакокинетику.

Метоксиэтильные производные АСО

АСО второго поколения были разработаны для улучшения некоторых характеристик ОДН первого поколения. Так фосфотиоатные структуры, добавленные к группам МОЭ в позиции 2", повышают их устойчивость к нуклеазам и изменяют эффективность связывания с белками.

Устойчивость МОЭ к нуклеазам

Было показано, что структура МОЭ влияет на устойчивость АСО к нуклеазам. В то время как фосфотиоатные структуры уменьшают активность экзонуклеазы, структура в позиции 2" практически исключает экзонуклеазную активность. Устойчивость к нуклеазам может быть результатом (1) замещения в позиции 2" водорода на МОЭ, (2) стерических эффектов МОЭ или (3) образования жёсткой водной оболочки вокруг скелета АСО . Какими бы не были причины устойчивости к нуклеазам, наличие группы МОЭ делает измененные в позиции 2" АСО практически невосприимчивыми к воздействию циркулирующих и к большинству клеточных нуклеаз. Центральный участок скелета АСО, состоящий из деоксифосфотиоатов, далеко не так устойчив к опосредованным нуклеазой расщеплениям. Различия АСО первого и второго поколений в участках, подверженных метаболизму, определяют и различия метаболических моделей.

При оценке моделей метаболизма с помощью капиллярного гель-электрофореза (КГЭ) или путём жидкостной хроматографии/масс спектрометрии (ЖХ/МС), не было обнаружено метаболитов, которые были бы короче на один нуклеотид. Больше всего было обнаружено метаболитов, расщеплённых в дезокси участке (предположительно эндонуклеазами), дальнейший путь метаболизма заключается в уменьшении размеров продуктов расщепления. Устойчивость к экзонуклеазам и медленный метаболизм под влиянием действующих эндонуклеаз приводит к образованию соединений, характеризующихся большим периодом полувыведения.

Связывание МОЭ с белками

Экспериментальными исследованиями доказано, что фосфотиоатные АСО со структурами 2"-МОЭ имеют меньшее сродство к белкам плазмы, в сравнении с немодифицированными фосфотиоатными АСО. Например, при добавлении пяти структур МОЭ к 3"-концам фосфотиоатных ОДН первого поколения, константы диссоциации для альбуминов повышаются от примерно 18 до примерно 40 мкM. При этом, в полностью замещённой МОЭ структуре АСО только слегка снижается сродство к белкам плазмы . Почему увеличение количества структур МОЭ в олигонуклеотиде не влияет на дальнейшее уменьшение сродства к белкам плазмы не ясно, но может быть это связано с особенностями вторичной структуры АСО.

Уменьшение сродства к белкам, связанное со структурами МОЭ, можно обосновать некоторыми физическими свойствами. Вероятно наиболее значительным физическим фактором, который отличает модифицированные МОЭ АСО от немодифицированных – это наличие молекулярной оболочки воды, которая возникает из-за боковой цепи МОЭ . Заместители МОЭ в углеводородном скелете «хелатируют» молекулы воды (и, возможно, ионы металлов), образуя водную оболочку, и уменьшая потенциальный контакт между «липкими» молекулами серы и плазменными или клеточными белками. Степень связывания АСО с белками обратно коррелирует с их выведением с мочой. Введение фосфотиоатных связей и заместителей 2"-МОЭ изменяет связывание с белками и в результате изменяет свойства АСО.

Всасывание, распределение, метаболизм и выведение АСО

Всасывание

Парентеральный путь введения АСО

Исследованиями установлено, что вследствие молекулярной массы (около 7000 Д) и отрицательных зарядов АСО, всасывание этих препаратов из ЖКТ ограничено. Именно поэтому, обычно применяется парентеральный путь их введения. Подкожные, внутривенные инфузии или интравитриальные инъекции используется для введения препаратов первого поколения. Меньшая провоспалительная активность АСО второго поколения делает их более подходящими для подкожного введения. Фармакокинетика этих препаратов в плазме при подкожных инъекциях и внутривенных инфузиях сравнима. Исследования на лабораторных животных показывают, что, в конечном счёте, распределение АСО так же сопоставимо по различным органам, за исключением места введения и лимфатических узлов.

После подкожного введения, АСО как первого, так и второго поколения всасываются быстро из места введения в системный кровоток. В клинических исследованиях после подкожного введения АСО второго поколения время достижения максимальной концентрации (T max), находится в пределах от 1,5 до 4,7 часа в диапазоне доз от 25 до 200 мг при постоянном объёме 1 мл . Биодоступность подкожной дозы лежит в пределах от 36 до 82% от введенной дозы. Доклинические и клинические исследования предполагают, что биодоступность АСО повышается в зависимости от концентрации.

Кинетика АСО в месте введения может повлиять на местный ответ, также как на их системную кинетику и на распределение. Уменьшение концентрации АСО в месте введения гипотетически уменьшает местный ответ на инъекцию. Одним из подходов к снижению концентрации АСО в месте введения является разведение раствора и, как следствие, повышение площади поверхности всасывания из подкожного депо. Теоретически, разведение растворов и большая площадь поверхности всасывания должны уменьшить местную концентрацию и снизить местные реакции. Этих же эффектов можно было бы ожидать и при повышении системного всасывания. Поэтому изменения дозы и объёма можно рассматривать как потенциальные переменные величины. Однако даже на сегодняшний день подкожные инъекции с низкими объёмами и относительно высокими концентрациями демонстрируют высокую биодоступность применяемого материала.

Местное введение АСО

Изучение различных приёмов введения АСО демонстрирует, что их аэрозольные формы, ректальное введение и интравитриальные инъекции используются как средства местного введения. Для лечения лёгочных заболеваний возможно создавать относительно высокие концентрации АСО в лёгких используя аэрозоли .

Кинетика ОДН первого поколения была изучена на мышах. Установлено, что кинетика таких препаратов дозозависима, клиренс – лёгочный с периодом полувыведения около 2 часов. В отличие от этого, исследования модифицированных МОЭ АСО второго поколения, показывают, что период их полувыведения составляет более 4 дней. Так же как и для другого местного лечения, преимущество ингаляций заключается в возможности создать высокие местные концентрации в тканях, которые обычно не накапливают применяемых веществ. В лёгких АСО обычно не накапливаются после парентерального введения. Местное введение так же редко вызывает системные эффекты. Например, при введении АСО обезьянам в дозе 0,1 мг/кг с помощью ингаляций (по три дозы в течение 1 недели) концентрация препарата в лёгких составляла примерно 1 мкг/г. Но у этих же обезьян, концентрация в печени и почках составила примерно 5% от концентрации в лёгких, свидетельствуя о существенно меньшем системном эффекте .

Данные литературы свидетельствуют о том, что ректальное введение АСО с успехом используется для лечения язвенных колитов. В отличие от ингаляций, где могут использоваться небольшие количества вводимого вещества, применяемая для лечения клизма может содержать до 240 мг вещества (alicaforsen) первого поколения. В данном случае эпителий прямой кишки подвергается воздействию вводимого вещества, однако из-за плохой проницаемости сильно заряженных ОДН, наблюдается минимальное всасывание препарата, как и общий системный эффект. Расчёты показывают, что концентрация АСО в эпителии кишечника через 12 часов после введения составляет 20 мкг/г. Биодоступность у человека лежит в пределах от 0,03 до 2,14% и максимальная концентрация АСО, определяемая в плазме, составляет только 0,126 мкг/мл . Отсутствие значительного системного всасывания и высокая местная концентрация лечебного препарата положительно сказываются на лечении.

Проведено исследование интравитреальных инъекций препаратов АСО как первого, так и второго поколений. В данном случае вещества вводятся в глаз в очень маленьких количествах. Вследствие изоляции места введения, системные эффекты препарата снижаются в ещё большей степени. В глазу, в стекловидное тело и сетчатку АСО поступают с разной скоростью: в стекловидное тело быстрее по сравнению с сетчаткой. И местный метаболизм, и диффузия из глаза способствуют выведению препарата. Как уже отмечалось, из-за небольших количеств системный эффект вводимого препарата оказывается минимальным. Однако, при этом механизм системного распределения сходен с большинством других препаратов.

Энтеральное введение АСО

Отмеченная стабильность АСО второго поколения к нуклеазам обеспечивает стабильность препарата в кишечнике, что делает возможным его дальнейшее всасывание. Тем не менее, размер молекулы и заряды АСО ограничивают всасывание препарата. После всасывания из кишечника, кинетика АСО подобна таковой при его парентеральном введении. Хотя печень является одним из главных мест накопления АСО, эффект первого прохождения через печень не является важным фактором, влияющим на кинетику препарата АСО .

Распределение АСО в организме

Роль перфузионного и тканевого сродства

Распределение АСО и других препаратов зависит от проницаемости, интенсивности кровоснабжения, связывания с белками плазмы, тканей и клеток. Показано, что распределение в тканях фосфотиоатных АСО первого и второго поколения с их множественными отрицательными зарядами и их связыванием с белками в наименьшей степени зависит от кровоснабжения, и гораздо более зависит от факторов, влияющих на их транспорт внутрь клетки.

Внутреннее распределение из плазмы в ткани относительно быстрое, период полувыведения составляет 30-90 минут после в/в введения. Период полувыведения АСО после подкожного введения больше, чем после в/в. Это отличие происходит из-за времени, необходимого для всасывания, а не из-за других отличий фармакокинетики .

Изучение кинетики препаратов первого и второго поколения отметило её небольшие отличия. Большая стабильность к нуклеазам АСО второго поколения компенсируется меньшим их связыванием с белками. Наряду с этим, фармакокинетические профили препаратов 1-го и 2-го поколения сходны или почти неотличимы, если сумму нативного АСО и его метаболитов (общие АСО) первого поколения сравнивать с интактным препаратом второго поколения (ISIS 13650). В противном случае, более быстрое разрушение АСО экзонуклеазами укорачивало бы период полувыведения препаратов первого поколения в сравнении со вторыми. Распределение препаратов обоих поколений дозозависимо .

Как отмечалось выше, после всасывания из места инъекции или кишечника АСО связываются с белками плазмы. Два белка плазмы, которые точно связываются с фосфотиоатными АСО – это альбумин и альфа-2-макроглобулин. Другой распространённый белок, кислый гликопротеин не связывает АСО . Связывание с белками очень важно для распределения АСО в ткани-мишени. Химические структуры, уменьшающие связывание приводят к заметному снижению концентрации препарата в тканях, повышают степень его фильтрации через почечные клубочки и выведения с мочой. Это явление можно наблюдать при использовании АСО с диэфирными связями в скелете препарата или при наличии структуры МОЭ. Уменьшение сродства диэфиров и МОЭ-структур (или и то, и то) к белкам позволяет более свободно циркулировать АСО в кровотоке, приводя к интенсификации его выведения с мочой .

Во всех исследованиях с парентерально введенными АСО первого и второго поколения, мы не наблюдали линейного клиренса АСО из плазмы. Клиренс уменьшался с увеличением дозы препарата, и, следовательно, его биодоступность была большей, чем можно было предположить исходя из введённой дозы . Поскольку начальный клиренс обусловлен распределением АСО в тканях и при этом наблюдалось поглощение препарата тканями, можно предположить возможность их насыщения АСО. Изучение процесса насыщения в результате введений АСО может проводиться с использованием фагоцитов печени. Когда связывание АСО с клетками Купфера достигнет насыщения, начнётся уменьшение сродства. Последующее введение АСО мышам улучшает распределение АСО по не фагоцитарным клеткам печени, и в результате улучшается фармакологическая активность в гепатоцитах в сравнении с контролем. И, наоборот, при концентрации в плазме ниже 1 мкг/мл АСО активнее связываются с клетками Купфера, и меньше накапливаются в гепатоцитах.

Исследование процесса связывания АСО с белками плазмы показало, что этот эффект сопровождается быстрым распределением комплекса в тканях по поверхности клеток. Хотя точные механизмы клеточного связывания не установлены, можно предположить, что АСО связываются с белками плазмы или с клеточными белками, пока есть свободные участки связывания. Затем связанные АСО распределяются по градиенту концентрации через клеточную мембрану путём обмена внеклеточного белка на внутриклеточный.

Таким образом, движущей силой попадания АСО в клетки является градиент концентраций. Было описано челночное движение АСО между цитоплазмой и ядром . В целом, является очевидным, что связывание с белками облегчает движение АСО через барьеры, которые обычно тормозят движение гидрофильных сильно заряженных молекул. Данный челночный механизм движения через мембраны остаётся гипотезой для АСО, но ранее он был описан для металлоорганических соединений . Транспорт АСО из внеклеточного матрикса во внутриклеточное пространство был визуализирован на печени мышей при помощи иммуногистохимических методов и на почках крыс с помощью витальной микроскопии с флуоресцентной меткой для АСО второго поколения (S. Henry, B. Molitoris).

Идентичность белков, контролирующих транспорт АСО из внеклеточного во внутриклеточное пространство не известна, однако считается, что связывание комплекса белок-АСО с клеткой осуществляется при помощи фагоцитарного рецептора . Поскольку высоким сродством к АСО обладают фагоциты, такие как клетки Купфера, тканевые макрофаги и клетки проксимальных канальцев, можно думать о возможности нахождения таких рецепторов на их клеточной поверхности .

Тем не менее, клеточное распределение и фармакодинамика АСО у трансгенных мышей, лишённых фагоцитарного рецептора SR-A I/II не отличались от таковых показателей контрольных сингенных животных . Таким образом, этот рецептор, известный как «рецептор для уборки мусора» (Scavenger receptor), по-видимому, не ответственен за поглощение комплекса печенью и почками. Роль других акцепторных структур, участвующих в процессах эндоцитоза комплекса АСО-белок, не изучена.

Мембранные белки, функционирующие как переносчики, присутствуют во всех организмах . Основными переносчиками лекарственных средств являются: ABC (ATP-binding cassette transporters) и SLC (solute carrier family). Известно, что скорость переноса веществ через биологические мембраны с помощью процессов, опосредованных транспортёрами, характеризуется насыщаемостью. Описано несколько членов семейства SLC с известными функциями, в основном для переноса нуклеозидов, нуклеозид-сахаров и фосфат-сахаров. Есть мнение, что будущие исследования, скорее всего, будут касаться процессов межмембранного транспорта АСО.

Ясно, что помимо указанных выше отличий в накоплении создаваемых конструкций разными органами и тканями и зависимости клиренса и распределения таких соединений от их дозы, на распределение АСО в тканях оказывают влияние транспортные системы, особенности кровотока особей, возможное время нахождения препарата в организме и, наконец, насыщаемость тканей АСО. Несмотря на существенную роль указанных факторов в процессах тканевого распределения АСО, считается, что начальное связывание АСО с поверхностью клетки является одним из определяющих факторов в анализируемых механизмах. Такое заключение основывается на том, что печень и почки являются начальными участками связывания АСО с некоторым дополнительным накоплением в первые 24 часа после введения АСО . При изучении параметров распределения АСО в печени и почках показано фракционное повышение концентрации препарата в органах в течение первых 24 часов. Это происходит в период клеточного и субклеточного перераспределения АСО , но предположительно, первичные органы распределения должны накапливать больше вещества с течением времени из-за большего сродства этих органов к АСО. Белки, ответственные за это сродство могут содержать гепариноподобные участки связывания ламинина и фибриногена, и фактор роста фибробластов (FGF, Fibroblast growth factor) . Раннее взаимодействие АСО с клеткой может быть обусловлено связыванием этих белков, но природа этих белков, как отмечалось выше, изучена мало.

Рассматривая значимость сочетания специфических участков связывания АСО с клетками в распределении препарата в организме, следует отметить и такой важный фактор, как различное кровоснабжение разных органов, возможность которого влиять на различное распределение фосфотиоатных АСО очевидна. По данным разных авторов, работа с десятками серий веществ как первого, так и второго поколений свидетельствует об их сходном распределении, и заметно подобном распределении у особей различных видов. Почки, печень, лимфатические узлы, селезёнка и костный мозг – это органы, накапливающие самое большое количество АСО и их метаболитов. То, что лёгкие и сердце не накапливают АСО, свидетельствует о том, что для объяснения выраженного накопления АСО в печени и почках недостаточно только одного объяснения об их хорошем кровоснабжении. Например, участки с наилучшим кровообращением в почках – это клубочки, а они не являются участками, содержащими большее количество АСО. Напротив, в проксимальных канальцах кровообращение менее активно. Однако клетки проксимальных канальцев характеризуются большим количеством активно фагоцитирующих клеток, накапливают свободные АСО, а так же АСО, связанные с белками, которые обычно реабсорбируются в проксимальных канальцах . В результате почечная кора и эпителий проксимальных канальцев содержат самую высокую концентрацию фосфотиоатных АСО, как первого, так и второго поколения.

Следует отметить также, что кровоснабжение (мл/г ткани) печени составляет примерно 20% от почечного. 4-5-кратные различия в перфузии между почками и печенью не приводят к 4-5-кратным различиям в концентрации АСО в этих органах. Окончатые капилляры увеличивают площадь соприкосновения АСО с кровотоком и, следовательно, это может компенсировать недостаточную перфузию печени относительно почек.

Связывание АСО с белками плазмы при распределении

Хотя насыщение клеток АСО в конечном счёте влияет на их распределение в органах, связывание АСО с белками плазмы может изменять распределение в почках и печени в различных сериях. Существуют посерийные различия в связывании с белками. При снижении связывания АСО с белками плазмы происходит уменьшение их накопления в печени и повышение их накопления в почках. И, наоборот, при более высоком связывании, концентрация АСО в свободном виде в кровотоке будет находиться в меньшем количестве, меньше накапливаться в почках и больше в других органах. Существует обратная зависимость между степенью связывания АСО с белком и накоплением их в почках крыс и обезьян после повторяющегося внутривенного и подкожного введения.

Связывание с белками может быть использовано как критерий выбора АСО для клинических исследований. К настоящему времени, определение связывания с белками – это эмпирический процесс без возможности предсказать, какая серия будет связываться с белками больше или меньше.

Распределение АСО по другим органам

Независимо от последовательности распределения фосфотиоатных АСО первого и второго поколения, наблюдается характерная картина локализации этих препаратов в почках и печени, а также в селезёнке и лимфатических узлах, кости и в цитоплазме адипоцитов . Накопление АСО в лимфоидной ткани можно объяснить отчасти фагоцитарной активностью гистиоцитов и других мононуклеарных клеток. Возможно, визуализировать АСО в фаголизосомах гистиоцитов и тканях макрофагов при помощи гематоксилинового окрашивания. Показано, что АСО подвергаются эндоцитозу, локализуются в эндосомах и сохраняются в пределах этих структур. Концентрация АСО в фаголизосомах часто такова, что её возможно определить методом окрашивания гематоксилином (почти как ядерную ДНК). АСО в фаголизосомах вероятно составляет большую часть АСО, накопленных в селезёнке и лимфоидных органах. Кроме того, фагоцитарно активные клетки костей и костного мозга накапливают АСО в этих тканях, что подтверждается наличием базофильных гранул в их клетках.

Мышцы (как скелетные, так и сердечные) не содержат значительного количества АСО. Тем не менее, внимательное изучение мышц с использованием иммуногистохимических или авторадиографических методов показывает содержание АСО в фаголизосомах макрофагов стромы мышц и это накопление может частично отразиться и на измерении концентрации АСО в мышцах и сердце.

Накопление АСО в цитоплазме адипоцитов значимо с терапевтической точки зрения. Особенно потому, что в отличие от большинства накапливаемых в адипоцитах веществ, АСО гидрофильны. Иммуногистохимические методы ясно показывают, что АСО находятся в цитоплазматической фракции адипоцитов, при этом АСО почти нет в жировой вакуоли. Интенсивность окрашивания указывает на значительное накопление вещества в цитоплазме. Например, у обезьян после 13 недель лечения препаратом ISIS 113715 в дозе 10 мг/кг/неделя концентрация в печени составила 301 ± 88,1 мкг/г, но только 37,3 ± 14,4 мкг/г в жировой ткани у тех же животных.

Учитывая, что нежировой компонент составляет 10% от общей жировой массы, коррекция концентрации АСО с учётом этого показателя свидетельствует о сопоставимости его концентрации с таковой в печени. Значительные концентрации АСО в адипоцитах показывают, что их можно использовать для лечения генетических заболеваний клеток этого типа: источников гормонов и цитокинов. Так, установлено, что фармакологически активные концентрации АСО регистрируются в адипоцитах мышей при введении препарата ISIS 113715 в дозе 25 мг/кг дважды в неделю и снижают экспрессию гена-мишени PTP-1B как в печени, так и в адипоцитах . Аналогичные наблюдения были сделаны у обезьян, получавших АСО ISIS 113715. Поскольку биопсию подкожного жира можно провести в клинических условиях и так как активные АСО накапливаются в жире, то можно использовать жир для биопсии и непосредственного измерения фармакологических эффектов (снижение мРНК) и тканевой концентрации препарата в тканях человека.

Фосфотиоатные АСО распределяются и в другие ткани. Иммуногистохимические исследования показывают, что эндотелиальные клетки накапливают АСО в концентрациях, значительных для уменьшения уровня мРНК, делая их потенциальной мишенью для фармакологического воздействия . В некоторых тканях их концентрации не достаточно велики для фармакологического эффекта. Например, зрелые лимфоциты не накапливают АСО, а антисмысловая активность проявляется T-клетками ограниченно.

Костные клетки, особенно фагоцитарно активные остеобласты, могут накапливать АСО и этот эффект может быть использован в терапевтических целях. Кроме того, клетки островков поджелудочной железы также накапливают АСО. АСО как первого, так и второго поколения являются сильно заряженными гидрофильными молекулами, которые не проникают через гемато-энцефалический или гемато-тестикулярный барьеры. Однако, как и в мышцах, в интерстициальном участке яичек локализуются макрофаги, содержащие обнаруживаемые АСО. Яичники не отделены барьером, вследствие этого АСО можно количественно измерить в яичниках и визуализировать иммуногистохимическими методами в строме.

Ограниченное распределение АСО из плазмы крови в клетки мозга и кардиомиоциты делает эти ткани маловероятными мишенями антисмыслового вмешательства, несмотря на то, что селективное ингибирование или экспрессия некоторых белков ионных каналов в головном мозге и мышцах могут быть терапевтически полезны. Тем не менее, ограниченное распределение АСО в этих тканях можно рассматривать как преимущество. Отсутствие значительных концентраций АСО в мозге и сердце уменьшает риск поражения центральной нервной системы (ЦНС) и снижает проявление нежелательных сердечных эффектов. Как отмечалось ранее, прямое введение в структуры ЦНС, в частности, в головной мозг, с помощью интратекальной, внутрижелудочковой инфузии или инъекции вызывает распределение АСО в пределах центральной нервной системы и может быть полезно терапевтически .

При беременности плод достаточно хорошо защищен от воздействия антисмысловых препаратов. Изучение трансплацентарной кинетики АСО не выявило его накопления в плоде, отмечен низкий уровень АСО у грызунов в плаценте . Эти результаты были последовательно воспроизведены при исследовании тератогенности различных АСО второго поколения на мышах, крысах и кроликах. Плацента, несмотря на высокую перфузию, не является органом с высоким накоплением АСО .

В целом, представленные факты показывают, что распределение АСО является одним из ключевых факторов, который определяет выраженность активности АСО. Отличия в распределении АСО, как представляется, связаны в значительной степени с тропностью тканей для этих препаратов и, в меньшей степени, с перфузией.

Метаболизм

Антисмысловые препараты первого и второго поколения метаболизируются нуклеазами, а не системами оксидаз типа цитохрома P450, с помощью которого метаболизируются обычные липофильные низкомолекулярные препараты. АСО не являются ни субстратом изоферментов цитохрома P450, и не индуцируют или ингибируют его активность в клинически значимых концентрациях. Опосредованное экзонуклеазами расщепление АСО, которое является основным путём метаболизма и клиренса фосфотиоатных ОДН первого поколения, вторично для АСО второго поколения. Ограничивают экзонуклеазную активность два фрагмента: один МОЭ на 3"-конце и другой МОЭ на 5"-конце.

Ферменты, ответственные за метаболизм АСО

Специфические ферменты, метаболизирующие АСО второго поколения не известны. Нуклеазы являются повсеместно распределёнными и есть возможность определить расщеплённые метаболиты АСО в большинстве тканей. Печеночный и почечный гомогенаты – оба способны метаболизировать АСО второго поколения in vitro без добавления экзогенных источников энергии, таких как никотинамидадениндинуклеотидфосфат (NADPH) или аденозин-5-трифосфат (АТФ). Начальное расщепление приводит к образованию двух продуктов, каждый из которых характеризуется защищённым MOE концом 5" и 3". Эти метаболиты не связываются с белками, и, таким образом, выводятся из тканей. Поскольку метаболиты удаляются быстрее, чем они образуются, накопление метаболитов в тканях практически не происходит. Таким образом, не представляется возможным использовать определение количества метаболитов в ткани, как индекса метаболизма АСО в тканях.

Поскольку скорость выведения АСО из тканей зависит от их метаболизма, то различия в метаболизме АСО в различных тканях могут быть оценены на основе периода полувыведения этих препаратов из характеризуемых тканей. На основе данных для четырёх АСО второго поколения, заключено, что поведение членов этого класса сходно, однако прослеживаются небольшие различия в периоде их полувыведения из печени и почек обезьян, получавших препарат в течение 4-13 недель. Показано, что период полувыведения препаратов АСО ISIS 104838 и 112989 из печени и почек весьма сходен. Эти данные дают возможность предположить, что для некоторых серий АСО не существует значительных различий в скорости метаболизма в различных органах. Однако различия в тканевом периоде полувыведения выявлены для препаратов ISIS 107248, 113715, а также 301012. Обнаруженные различия в скорости метаболизма препаратов АСО в печени и почках показывают, что в разных тканях могут быть различия в скорости метаболизма, или имеет место более сложная кинетика для некоторых серий препарата, или полученные результаты просто отражают небольшое количество образцов, взятых в течение ограниченного времени.

Детальное исследование процесса выведения АСО второго поколения показывает наличие разных темпов их выведения из различных типов клеток печени . Поскольку некоторые типы клеток, такие как клетки проксимальных канальцев коркового слоя почки, как правило, содержат АСО в фаголизосомах, этот тип поглощения, вероятно, определяет различия в метаболических скоростях препарата в разных тканях. Кроме того, вполне вероятно, что специфические последовательности в строении скелета АСО могут характеризоваться различной чувствительностью к расщеплению эндонуклеазами.

Бактериальные экзонуклеазы проявляют высокую степень специфичности к последовательности нуклеотидов в скелете АСО предположительно для защиты от вирусов. Большая часть активности нуклеаз в клетках млекопитающих связана с механизмами транскрипции и репарации ДНК, и, таким образом, видовая специфичность млекопитающих может отличаться от таковых бактериальных эндонуклеаз. Не известно, одинаково ли ответственны за катаболизм этих синтетических АСО процессы репликации и действие ферментов, связанных с явлением репарации. При высоких концентрациях оцДНК , АСО могут эффективно конкурировать с природным субстратом. Множество ферментов семейства нуклеаз способны катаболизировать АСО. Определение специфических ферментов, участвующих в метаболизме АСО не критично для развития антисмысловых препаратов, но, более глубокое понимание метаболических путей будет полезно для развития новых технологий.

Метаболиты АСО

Различия в метаболизме АСО первого и второго поколений весьма очевидны при сравнении метаболического профиля с КГЭ. Когда образцы ткани или мочи анализируются в детекторе LC/MS, характер метаболических процессов становится более ясным . Как правило, фосфоротиоатные ОДН первого поколения метаболизируются в каскад метаболитов АСО, каждый из которых отличается на один нуклеотид в результате однонуклеотидных расщеплений экзонуклеазой. Так, после введения 20-mer, то есть состоящего из 20 нуклеотидов, ОДН первого поколения плазма и ткани содержат семейства последовательно сокращенных АСО, начиная с 19-mer и далее вплоть до короткого АСО.

Исходное расщепление в метаболизме АСО второго поколения, опосредованное
эндонуклеазами, приводит к образованию двух АСО, один с 3"-концом MOЭ и другой с 5"-концом MOЭ. Расщепление продуктов с незащищёнными концами, может проводиться либо 5"-экзонуклеазой или 3"-экзонуклеазой. Результаты комбинированной эндо- и экзонуклеазной активности – это каскад цепочечно сокращённых продуктов расщепления, многие, если не все, из которых могут быть выявлены в моче, собранной у обследуемых животных или людей. Моча животных, принимавших препарат, или пациентов, лечившихся АСО второго поколения, может содержать метаболиты, которые варьируются от двух возможных 15-mer до двух возможных MOЭ 5-mer и множественных комбинаций каждого из промежуточных метаболитов .

Метаболиты короче, чем длина концов MOЭ будут присутствовать в тканях, если концы MOЭ сами являются субстратами для нуклеаз. Эти метаболиты обычно не определяются при масс-спектральном анализе, что наводит на мысль, что как правило, нет мононуклеотидов MOЭ, выделяющихся в процессе метаболизма. Тем не менее, некоторые исключения из этого обобщения имеют место. Для ограниченного числа последовательностей нуклеотидов, наблюдаются однонуклеотидные обрезки АСО второго поколения в тканях и плазме – либо КГЭ или LC/MS: метаболиты, по-видимому, были результатом экзонуклеазного расщепления. Эти метаболиты могут наблюдаться в начальном распределении. Предполагается, что они быстро появляются в плазме крови. MOЭ-мононуклеотиды, которые образуются в процессе метаболизма, не являются субстратами для фосфорилирования, и таким образом, вряд ли будут включены в нуклеотидтрифосфаты и, в конечном счёте, в эндогенные нуклеотиды. MOЭ-мононуклеотиды не ингибируют ферменты, ответственные за синтез ДНК. Таким образом, MOЭ-мононуклеотиды, если они образовались, не должны встраиваться в эндогенные нуклеотиды.

Центральная часть дезоксинуклеотидов АСО второго поколения подлежит экзонуклеазному расщеплению, что приводит к высвобождению одного нуклеотида. Монодезоксинуклеотиды, которые получаются путём экзонуклеазного расщепления, идентичны эндогенным нуклеотидам, за исключением тиофосфатной группы, которая может теоретически присутствовать. Тем не менее, тиофосфатная группа лабильна к окислению и к утрате серы, что делает группу концевого фосфата идентичной эндогенным нуклеотидам. Поэтому, в отличие от MOЭ-мононуклеотидов, любой высвобождённый дезоксинуклеотид будет естественно включён во внутриклеточное депо эндогенных нуклеотидов. Нуклеотиды, которые сохраняют тиофосфатные группы, будут субстратами для добавления одной или двух фосфатных групп, в результате чего получаются смешанные тиофосфатные ди- или трифосфаты нуклеотида. Фосфорилирование возможно, но присутствие альфа тиофосфата делает реакции термодинамически неблагоприятными .

Заключение

Очевидна актуальность исследования фармакокинетики данных и схожих с описанными препаратов, а так же создание моделей на различных видов животных для полного понимания процессов протекающих в организме после приема препаратов. В России так же ведутся исследования подобных препаратов.

Литература

1. Adjei A.A., Dy G.K., Erlichman C. et al. A phase I trial of ISIS 2503, an antisense inhibitor of H-ras, in combination with gemcitabine in patients with advanced cancer. // Clin. Cancer Res. 2003. Vol. 9, №1. P. 115.

2. Benimetskaya L., Loike J.D., Loike G. et al. Mac-1 (CD11b/CD18) is an ODN-binding protein. // Nat. Med. 1997. Vol. 3, №4. P. 414.

3. Benimetskaya L., Tonkinson J.L., Koziolkiewicz M. et al. Binding of phosphorothioate ODNs to basic fibroblast growth factor, recombinant soluble CD4, laminin and fibronectin in P-chirality independent. // Nucl. Acids Res. 1995. Vol. 23, №21. P. 4239.

4. Bijsterbosch M.K., Manoharan M., Rump E.T. et al. In vitro fate of phosphorothioate antisense ODNs: predominant uptake by scavenger receptors on endothelial cells. // Nucl. Acids Res. 1997. Vol. 25, №16. P. 3290.

5. Bijsterbosch M.K., Rump E.T., De Vrueh R.L. et al. Modulation of plasma protein binding and in vitro liver cell uptake of phosphorothioate ODNs by cholesterol conjugation. // Nucl. Acids Res. 2000. Vol. 28, № 14. P. 2717.

6. Brown D.A., Kang S.H., Gryaznov S.M. et al. Effect of phosphorothioate modification of ODNs on specific protein binding. // J. Biol. Chem. 1994. Vol. 269, №43. Р. 26801.

7. Butler M., Crooke R.M., Graham M.J. et al. Phosphorothioate ODNs distribute similarly in class A scavenger receptor knockout and wild-type mice. // J. Pharmacol. Exp. Ther. 2000. Vol. 292, №2. P. 489.

8. Butler M., Hayes C.S., Chappell A., Murray S.F., Yaksh T.L., Hua X.Y. Spinal distribution and metabolism of 2_-O-(2-methoxyethyl)-modified ASOs after intrathecal administration in rats. // Neuroscience. 2005. Vol. 131, №3. P. 705.

9. Butler M., Stecker K., Bennett C.F. Cellular distribution of phosphorothioate ODNs in normal rodent tissues. // Lab. Invest. 1997. Vol. 77, №4. P. 379.

10. Cossum P.A., Sasmor H., Dellinger D. et al. Disposition of the 14C-labeled phosphorothioate ASO ISIS 2105 after intravenous administration to rats. // J. Pharmacol. Exp. Ther. 1993. Vol. 267, №3. P. 1181.

11. Cossum P.A., Troung L., Owens S.R. et al. Pharmacokinetics of a 14C-labeled phosphorothioate ASO, ISIS 2105, after intradermal administration to rats. // J. Pharmacol. Exp. Ther. 1994. Vol. 269, №1. P. 89.

12. Crooke S.T., Graham M.J., Zuckerman J.E. et al. Pharmacokinetic properties of several novel ASO analogs in mice. // J. Pharmacol. Exp. Ther. 1996. Vol. 277, №2. P. 923.

13. Driver S.E., Robinson G.S., Flanagan J., Shen W., Smith L.E.H., Thomas D.W., Roberts P.C. ASO-based inhibition of embryonic gene expression. // Nat. Biotechnol. 1999. Vol. 17. P. 1184.

14. Eckstein F. Phosphorothioate ODNs: what is their origin and what is unique about them? //Antisense Nucl. Acid Drug Dev. 2000. Vol. 10, №2. Р. 117.

15. Gaus H.J., Owens S.R., Winniman M., Cooper S., Cummins L.L. On-line HPLC electrospray mass spectrometry of phosphorothioate ASO metabolites. // Anal. Chem. 1997. Vol. 69, №3. P. 313.

16. Geary R.S. Current assessment of PK/PD relationships for antisense therapeutics. // World Congress of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences, Nice, France, 2002.

17. Geary R.S., Bradley J.D., Watanabe T. et al. Lack of pharmacokinetic interaction for ISIS 113715, a 2_-O-methoxyethyl modified antisense oligonucleotide targeting protein tyrosine phosphatase 1B messenger RNA, with oral antidiabetic compounds metformin, glipizide or rosiglitazone. // Clin. Pharmacokinet. 2006. Vol. 45, №8. P. 789.

18. Geary R.S., Leeds J.M., Fitchett J. et al. Pharmacokinetics and metabolism in mice of a phosphorothioate ASO antisense inhibitor of C-raf-1 kinase expression.// Drug Metab. Dispos. 1997. Vol. 25, №11. Р. 1272.

19. Geary R.S., Leeds J.M., Henry S.P., Monteith D.K., Levin A.A. Antisense oligonucleotide inhibitors for the treatment of cancer: 1. Pharmacokinetic properties of phosphorothioate ODNs. // Anticancer Drug Des. 1997. Vol. 12, №5. Р. 383.

20. Geary R.S., Leeds J.M., Shanahan W. et al. Sequence independent plasma and tissue pharmacokinetics for 3 antisense phosphorothioate ASOs: mouse to man. // in American Association of Pharmaceutical Scientists, Pharm. Research, Plenum Press, Seattle, Washington. 1996. Р. S.

21. Geary R.S., Teng C.L., Truong L. et al. First pass hepatic extraction of a partially modified chimeric antisense oligonucleotides in Beagle dogs. // in Annual Meeting of the American Association of Pharmaceutical Scientists, Indianapolis, IN, 2000. P. 216.

22. Geary R.S., Ushiro-Watanabe T., Truong L et al. Pharmacokinetic properties of 2_-O-(2-methoxyethyl)-modified ASO analogs in rats. // J. Pharmacol. Exp. Ther. 2001. Vol. 296, №3. Р. 890.

23. Geary R.S., Yu R.Z., Levin A.A. Pharmacokinetics of phosphorothioate antisense ODNs. // Curr. Opin. Invest. Drugs. 2001. Vol. 2, №4. Р. 562.

24. Geary R.S., Yu R.Z., Watanabe T. et al. Pharmacokinetics of a tumor necrosis factor-alpha phosphorothioate 2_-O-(2-methoxyethyl) modified antisense oligonucleotides: comparison across species. // Drug Metab. Dispos. 2003. Vol. 31, №11. P. 1419.

25. Giacomini K.M., Sugiyama Y. Membrane transporters and drug response, in Goodman & Gilman’s The Pharmacological Basis of Therapeutics, 11th ed., Brunton, L.L., ed., McGraw-Hill, New York, 2006. P. 41.

26. Gleave M., Chi K.N. Knock-down of the cytoprotective gene, clusterin, to enhance hormone and chemosensitivity in prostate and other cancers. // Ann. NY Acad. Sci. 2005. Vol.1058. P. 1.

27. Gleave M., Miyake H. Use of antisense oligonucleotides targeting the cytoprotective gene, clusterin, to enhance androgen- and chemo-sensitivity in prostate cancer. // World J. Urol. 23. 2005. №1. P. 38.

28. Glover J.M., Leeds J.M., Mant T.G. et al. Phase I safety and pharmacokinetic profile of an intercellular adhesion molecule-1 antisense ODN (ISIS 2302). // J. Pharmacol. Exp. Ther. 1997. Vol. 282, №3. Р. 1173.

29. Graham M.J., Crooke S.T., Monteith D.K. et al. In vitro distribution and metabolism of a phosphorothioate ASOwithin rat liver after intravenous administration. // J. Pharmacol. Exp. Ther. 1998. Vol. 286, №1. P. 447.

30. Guvakova M.A., Yakubov L.A., Vlodavsky I., Tonkinson J.L., Stein C.A. Phosphorothioate ODNs bind to basic fibroblast growth factor, inhibit its binding to cell surface receptors, and remove it from low affinity binding sites on extracellular matrix. // J. Biol. Chem. 1995. Vol. 270. P.2620.

31. Henry S.P., Denny K.H., Templin M.V., Yu R.Z., Levin A.A. Effects of human and murine antisense oligonucleotide inhibitors of ICAM-1 on reproductive performance, fetal development, and post-natal development in mice. // Birth Defects Res. B Dev. Reprod. Toxicol. 2004. Vol. 71, №6. P. 359.

32. Hua X.Y., Moore A., Malkmus S. et al. Inhibition of spinal protein kinase C alpha expression by an antisense oligonucleotide attenuates morphine infusion-induced tolerance. // Neuroscience. 2002. Vol. 113, №1. P. 99.

33. Jackson J.K., Gleave M.E., Gleave J., Burt H.M. The inhibition of angiogenesis by antisense oligonucleotides to clusterin. // Angiogenesis. 2005. Vol. 8, №3. P. 229.

34. Kastelein J.J.P., Wedel M.K., Baker B.F. et al. Potent reduction of apolipoprotein B and Low-density lipoprotein cholesterol by short-term administration of an antisense inhibitor of apolipoprotein B. // Circulation. 2006. Vol. 114, №16. P. 1729.

35. Koziolkiewicz M., Krakoviak A., Kwinkowski M., Boczkowska M., Stec W.J. Stereodifferntiation – the effect of P chirality of oligo(nucleoside phosphorothioates) on the activity of bacterial RNase H. // Nucl. Acids Res. 1995. Vol.23, №24. Р. 5000.

36. Leeds J.M., Geary R.S. Pharmacokinetic properties of phosphorothioate ASOs in humans, in Antisense Research and Applications, 1st ed., Crooke, S. T., ed., Springer, Heidelberg, 1998. P. 217.

37. Leeds J.M., Henry S.P., Geary R.S., Burckin T.A., Levin A.A. Comparison of the pharmacokinetics of subcutaneous and intravenous administration of a phosphorothioate oligodeoxynucleotide in cynomolgus monkeys. // Antisense Nucl. Acid Drug Dev. 2000. Vol.10, №6. Р. 435.

38. Levin A.A. A review of issues in the pharmacokinetics and toxicology of phosphorothioate antisense oligonucleotides. // Biochim. Biophys. Acta. 1999. Vol.1489, №1. Р. 69.

39. Levin A.A., Geary R.S., Leeds J.M. et al. The pharmacokinetics and toxicity of phosphorothioate ASOs, in Biotechnology and Safety Assessment, 2nd ed., Thomas, J. A., ed., Taylor & Francis, Philadelphia, PA, 1998. Р. 151.

40. Levin A.A., Henry S.P., Bennett C.F. et al. Preclinical development of antisense therapeutics, in Novel Therapeutics from Modern Biotechnology: From Laboratory to Human Testing, 1st ed., Oxender D.L. and Post L.E., eds., Springer-Verlag, Heidelberg, Germany, 1998. Р. 131.

41. Levin A.A., Henry S.P., Monteith D., Templin M. Toxicity of antisense oligonucleotides. // in Antisense Drug Technology, Crooke, S. T., ed., Marcel Dekker, New York, 2001. P. 201.

42. Loke S.L., Stein C.A., Zhang X.H. et al. Characterization of ASO transport into living cells. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1989. Vol. 86. P. 3474.

43. Lorenz P., Misteli T., Baker B.F., Bennett C.F., Spector D.L. Nucleocytoplasmic shuttling: a novel in vitro property of antisense phosphorothioate ODNs. // Nucl. Acids Res. 2000. Vol. 28, №2. P. 582.

44. Miner P.B., Geary R.S., Matson J. et al. Bioavailability and therapeutic activity of alicaforsen (ISIS 2302) administered as a rectal retention enema to subjects with active ulcerative colitis. // Ailment Pharmacol. Ther. 2006. Vol. 23, №10. Р. 1427.

45. Mou T.C., Gray D.M. The high binding affinity of phosphorothioate-modified oligomers for Ff gene 5 protein is moderated by the addition of C-5 propyne or 2_-O-methyl modifications. // Nucl. Acids Res. 2002. Vol. 30, №3. Р. 749.

46. Nicklin P.L., Craig S.J., Phillips J.A. Pharmacokinetic properties of phosphorothioates in animals-absorption, distribution, metabolism and elimination, in Antisense Research and Applications, 1st ed., Crooke, S. T., ed., Springer, Berlin, 1998. P. 141.

47. Peng B., Andrews J., Nestorov I. et al. Tissue distribution and physiologically based pharmacokinetics of antisense phosphorothioate ASO ISIS 1082 in rat. // Antisense Nucl. Acid Drug Dev. 2001. Vol. 11, №1. P. 15.

48. Phillips J.A., Craig S.J., Bayley D. et al. Pharmacokinetics, metabolism and elimination of a 20-mer phosphorothioate ODN (CGP 69846A) after intravenous and subcutaneous administration. // Biochem. Pharmacol. 1997. Vol. 54, №6. Р. 657.

49. Sawai K., Mahato R.I., Oka Y., Takakura Y., Hashida M. Disposition of ASOs in isolated perfused rat kidney: involvement of scavenger receptors in their renal uptake. // J. Pharmacol. Exp. Ther. 1996. Vol. 279, №1. P. 284.

50. Sewell L.K., Geary R.S., Baker B.F. et al. Phase I trial of ISIS 104838, a 2_-methoxyethyl modified antisense oligonucleotides targeting tumor necrosis factor-alpha. // J. Pharmacol. Exp. Ther. 2002. Vol. 303, №3. Р. 1334.

51. Slim G., Gait M.J. Configurationally defined phosphorothioate-containing oligoribonucleotides in the study of the mechanism of cleavage of hammerhead ribozymes. // Nucl. Acids Res. 1991. Vol. 19, №6. Р. 1183.

52. Snyder R.M., Mirabelli C.K., Crooke S.T. Cellular association, intracellular distribution, and efflux of auranofin via sequential ligand exchange reactions. // Biochem. Pharmacol. 1986. Vol. 35, №6. P. 923.

53. Soucy N.V., Riley J.P., Templin M.V. et al. Maternal and fetal distribution of a phosphorothioate ASO in rats after intravenous infusion. // Birth Defects Res. B Dev. Reprod. Toxicol. 2006. Vol. 77, №1. P. 22.

54. Spitzer S., Eckstein F. Inhibition of deoxyribonucleases by phosphorothioate groups in oligodeoxyribonucleotides. // Nucl. Acids Res. 1988. Vol. 16, №24. Р. 11691.

55. Stavchansky S., Geary R.S., Cho M. Pharmacokinetics and hepatic first pass effect of an antisense oligonucleotide (ISIS 2302) in rats. // in Annual Meeting of the American Association of Pharmaceutical Scientists, Indianapolis, IN, 2000. P. 216.

56. Templin M.V., Levin A.A., Graham M.J. et al. Pharmacokinetic and toxicity profile of a phosphorothioate ASO following inhalation delivery to lung in mice. // Antisense Nucl. Acid Drug Dev. 2000. Vol. 10, №5. Р. 359.

57. Teplova M., Minasov G., Tereshko V. et al. Crystal structure and improved antisense properties of 2_-O-(2-methoxyethyl)-RNA. // Nat. Struct. Biol. 1999. Vol.6, №6. Р.535.

58. Villalona-Calero M.A., Ritch P., Figueroa J.A. et al. A phase I/II study of LY900003, an antisense inhibitor of protein kinase C-alpha, in combination with cisplatin and gemcitabine in patients with advanced non-small cell lung cancer. // Clin. Cancer Res. 2004. Vol. 10, №18 Pt 1. P. 6086.

59. Watanabe T.A., Geary R.S., Levin A.A. Plasma protein binding of an antisense oligonucleotide targeting human ICAM-1 (ISIS 2302). // ASOs. 2006. Vol. 16, №2. P. 169.

60. White A.P., Reeves K.K., Snyder E. et al. Hydration of single-stranded phosphodiester and phosphorothioate oligodeoxyribonucleotides. // Nucl. Acids Res. 1996. Vol. 24, №16. Р. 3261.

61. Wilson D.M. 3rd, Ape1 abasic endonuclease activity is regulated by magnesium and potassium concentrations and is robust on alternative DNA structures. // J. Mol. Biol. 2005. Vol. 345, №5. P. 1003.

62. Yu D., Kandimalla E.R., Roskey A. et al. Stereo-enriched phosphorothioate ODNs: synthesis, biophysical and biological properties. // Bioorg. Med. Chem. 2000. Vol.8, №1. Р. 275.

63. Yu R.Z., Baer B., Chappel A. et al. Development of an ultrasensitive noncompetitive hybridization-ligation enzyme-linked immunosorbent assay for the determination of phosphorothioate ODN in plasma. // Anal. Biochem. 2002. Vol. 304, №1. P. 19.

64. Yu R.Z., Geary R.S., Leeds J.M. et al. Comparison of pharmacokinetics and tissue disposition of an antisense phosphorothioate ASO targeting human Ha-ras mRNA in mouse and monkey. // J. Pharm. Sci. 2001. Vol. 90, №2. P. 182.

65. Yu R.Z., Geary R.S., Levin A.A. Application of novel quantitative bioanalytical methods for pharmacokinetic and pharmacokinetic/pharmacodynamic assessments of antisense oligonucleotides. // Curr. Opin. Drug Discov. Dev. 2004. Vol. 7, №2. Р. 195.

66. Yu R.Z., Kim T.W., Hong A. et al. Cross species pharmacokinetic comparison from mouse to man of a second generation antisense oligonucleotide ISIS 301012, targeting human apolipoprotein B-100. // Drug Metab. Dispos. 2007. Vol. 35. P. 460.

67. Yu R.Z., Zhang H., Geary R.S. et al. Pharmacokinetics and pharmacodynamics of an antisense phosphorothioate ASO targeting Fas mRNA in mice. // J. Pharmacol. Exp. Ther. 2001. Vol. 296, №2. P. 388.

68. Zinker B.A., Rondinone C.M., Trevillyan J.M. et al. PTP1B antisense oligonucleotide lowers PTP1B protein, normalizes blood glucose, and improves insulin sensitivity in diabetic mice. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2002. Vol. 99, №17. P. 1137.

В большинстве методов генной терапии ех vivo и in vivo используются клонированные ге­нетические конструкции, возмещающие функ­циональную форму белка, который не синтези­руется в организме больного или синтезируется в дефектной форме. Однако многие заболевания человека (рак, воспаления, вирусные и парази­тарные инфекции) связаны, напротив, с гиперпродукцией нормального белка. Для лечения та­ких состояний разработаны терапевтические

системы с использованием специфических олигонуклеотидов. Такой небольшой олигонуклеотид может гибридизоваться со специфическим геном или мРНК и снижать уровень транскрипции или трансляции, уменьшая тем самым количество синтезируемого белка, ответственного за патологию. Олигонук­леотид, который гибридизуется с самим геном и блокирует его транскрипцию, называется «анти­генным», а тот, который гибридизуется с соот­ветствующей мРНК, - «антисмысловым» (Antisense RNA). Для предотвращения активации транскрип­ции специфических генов можно так-же использовать двухцепочечные олигонуклеотиды, специфично присоединя­ющиеся к ДНК-связывающим белкам (белкам-активаторам). Наконец, для уменьшения количества определенной мРНК и синтезируе­мого на ней белка можно использовать рибозимы - природные РНК-последовательности, которые связываются со специфическими моле­кулами РНК и разрезают их.

В будущем лекарст­венные средства на основе нуклеиновых кислот, по-видимому, найдут широкое применение, при этом главным объектом научных исследований и клинических испытаний будут различные «анти­смысловые» олигонуклеотиды.

3.1..«Антисмысловые» олигонуклеотиды как лекарственные средства

«Антисмысловая» РНК (Antisense RNA), которую предполагает­ся использовать в качестве лекарственного сред­ства, представляет собой короткий (15-20-нуклеотидов) олигонуклеотид, который может связываться с комплементарным ей определенным участком мРНК и ингибировать трансляцию кодируемого ей белка, подавляя тем самым патологический процесс (рис.2).

Терапевтический эффект синтетических «анти­смысловых» олигонуклео-тидов зависит от спе­цифичности их гибридизации с доступным сайтом мРНК-мишени, устойчивости к дейст­вию клеточных нуклеаз и наличия системы доставки в клетку. 15-20-нуклеотидные последо­вательности гибридизуются с уникальными мРНК с достаточно высокой специфичностью. Потенциальные сайты-мишени определяют тес­тированием набора «антисмысловых» олигону­клеотидов с использованием культуры клеток, синтезирующих мРНК-мишень. Для этого про­водят электрофоретическое разделение клеточ­ных белков, в которые включают радиоактив­ную метку во время трансляции, и с помощью радиоавтографии устанавливают, в присутст­вии какого из «антисмысловых» олигонуклеотидов снижается синтез определенного белка. Никаких общих критериев выбора наилучших сайтов-мишеней в разных РНК-транскриптах не существует. Эффективными могут оказаться олигонуклеотиды, комплементарные 5"- или 3"-концам мРНК, границам экзонов и интронов и даже двухцепочечным областям. Антисмысловые олигонуклеотиды могут разрушаться внутрикле­точными нуклеазами, поэтому важно защитить их от действия последних так, чтобы они не утра­тили способности к гибридизации с мишенью. Для этого можно модифицировать определен­ным образом пиримидиновые основания, рибозу или дезоксирибозу (рис.3). Так, у наиболее ши­роко применяющихся сейчас «антисмысловых» олигонуклеотидов свободный атом кислорода фосфодиэфирной связи заменен на группу SH (рис. 3Б), в результате чего образу­ется тиофосфатная связь. Модифицированные таким образом олигонуклеотиды растворяются в воде, несут отрицательный заряд и не расщеп­ляются под действием эндонуклеаз. При гиб­ридизации с сайтом-мишенью они образуют дуплексы, которые активируют рибонуклеазу (РНКазу), эндогенный фермент, расщепляющий мРНК в такой гибридной молекуле. Проведены первые клинические испытания та­ких олигонуклеотидов - лекарственных средств «первого поколения». Мишенями являются РНК цитомегаловируса, вируса иммунодефици­та человека, а также мРНК генов, ответственных за развитие рака, болезней кишечника и других заболеваний.

Синтезированы «антисмысловые» олигонук­леотиды с фосфорамидитной и полиамидной (пептидной) связями - пептидные нуклеиновые кислоты (Peptide nucleicacids, PNAs) (рис.3В и Г ). Такие молекулы очень устойчивы к действию нуклеаз. Химические группы, присоединенные к 2"-угле­родному атому сахарного остатка и С-5-атому пиримидинов, также защищают «антисмысло­вые» олигонуклеотиды и облегчают их связыва­ние с сайтом-мишенью (рис. 32Д и Е ). Все преимущества этих и других модификаций сей­час интенсивно изучаются.

Проникновение «антисмыловых» олигонук­леотидов в клетку можно значительно облег­чить, поместив их в липосомы. Такая высокоэффективная система доставки позволяет ис­пользовать «антисмысловые» олигонуклеотиды в небольших концентрациях. Если же конъюгировать липосомы с антителами, специфичными к эпитопам определенных клеток тех или иных органов, то можно будет осуществлять адресную доставку «антисмысловых» олигонуклеотидов.

Проведенные доклинические испытания оказали, что «антисмысловые» олигонуклеотиды являются весьма эффективными лекартвенными средствами. Изучена возможность их применения для лечения стеноза коронарых и сонных артерий, который приводит к инфарктам и инсультам. В этих случаях часто прибегают к ангиопластике, расширению артерий с помощью баллонного катетера, но примерно у 40% больных через 6 месяцев вновь возникают стенозы, поскольку ангиопластика стимулирует пролиферацию гладкомышечных клеток и секрецию межклеточного вещества во внутренний слой артерии в месте ее расширения. В одном из экспериментов в сонные артерии крыс после ангиопластики вводили антисмысловые» олигонуклеотиды с тиофосфатными связями, комплементарные мРНК, которые кодируют важные для клеточного циклa млекопитающих белки; в результате частота повторных стенозов уменьшилась на 90%. Пролиферация гладкомышечных клеток про­исходит также при атеросклерозе, сахарном диабете, осложнениях после коронарного шунтирования. Вероятно, все эти состояния можно будет контролировать аналогичными способами.

«Антисмыловые» олигонуклеотиды можно применять и для лечения вирусных инфекций и малярии. Кроме того, результаты I фазы клини­ческих испытаний лечения болезни Крона с по­мощью орального введения «антисмыслового» олигонуклеотида проиллюстрировали четко вы­раженный терапевтический эффект без замет­ных побочных эффектов. В этом случае мРНК-мишень кодировала межклеточный адгезии типа 1, который вырабатывается в избытке у па­циентов с болезнью Крона. Предполагается ис­следовать эффективность этого же олигонукле­отида для терапии других воспалительных заболеваний, например ревматоидного артрита, псориаза и язвенного колита.

В принципе «антисмысловые» олигонуклео­тиды могут образовывать тройную спираль с хромосомной ДНК-мишенью и блокировать транскрипцию. Однако пока специфичность «антигенных» олигонуклеотидов не соответст­вует стандартам, принятым для лекарственных средств.

Лекарство для генов

Давняя мечта медиков - иметь в своем распоряжении вещества, которые действовали бы на конкретные гены, т.е. на первопричину многих болезней. Ведь на основе таких веществ можно создавать лекарственные препараты - настоящие «волшебные пули», способные поражать наследственный материал различных инфекционных агентов, не принося вреда организму человека, а также подавлять активность онкогенов, ответственных за злокачественный рост клеток. Создание подобных веществ, направленно воздействующих на генетический материал, - одна из главных задач молекулярной биологии, поскольку с их помощью можно исследовать функции генов и, в конечном счете, управлять работой последних

Но каким образом можно изменить нужную генетическую программу? Ведь все гены имеют сходные химический состав и структуру: различия между ними сводятся лишь к порядку чередования четырех мономерных блоков - нуклеотидов A, T, G, C. Для того чтобы воздействовать на определенный ген, молекула вещества должна каким-то образом распознать эту нуклеотидную последовательность - задача, на первый взгляд, неразрешимая.

Но группа сибирских химиков, приехавших в Новосибирский академгородок в первые годы его создания, считала иначе. Сотрудники Института органической химии СО АН СССР (Новосибирск) Н. И. Гринева и Д. Г. Кнорре на основе принципа молекулярного узнавания, используемого самой природой, сформулировали идею направленного воздействия на гены с помощью олигонуклеотидов - фрагментов нуклеиновых кислот, «вооруженных» специальными химическими группами. Первую работу по олигонуклеотидам сибирские химики опубликовали в 1967 г. - именно эта дата и считается сегодня официальной датой возни­кновения нового направления в молекулярной биологии и фармакологии.

Они были первыми

Осуществление этого необычного по смелости проек­та (в то время нигде в мире даже не планировалось проведение подобных исследований) на начальной стадии велось небольшой группой молодых сотрудников, аспирантов и студентов НГУ. Начинать пришлось практически с нуля, поскольку тогда еще не умели синтезировать олигонуклеотиды в заметных количествах; не существовало технических приборов, необходимых для работы с малыми количествами нуклеиновых кислот и эффективной методики определения их последовательности. Решить эти проблемы нашим химикам удалось благодаря междисциплинарности - одному из принципов, легших в основу деятельности Сибирского отделения.

В НИОХ было организовано производство нуклеиновых кислот, разработаны методы их химической модификации; совместно с сотрудниками Института ядерной физики удалось создать приборы для анализа нуклеиновых кислот и манипуляции с их малыми количествами, а совместно с химиками МГУ - развернуть работы по созданию автоматических синтезаторов олигонуклеотидов. В результате в распоряжении ученых оказались практически все необходимые аналитические методы и приборы - биологические исследования можно было начинать.

Эксперименты, проведенные сначала на простых моделях, а затем на природных нуклеиновых кислотах, показали, что олигонуклеотиды действительно взаимодействуют с нуклеиновыми кислотами - мишенями с высокой степенью избирательности. В том случае, когда к олигонуклеотидам присоединены реакционно-способные группы, происходит направленная химическая модификация мишеней - нуклеиновых кислот. К тому же, впервые было продемонстрировано, что с помощью этих реагентов можно подавить вирусные инфекции у животных, а также доказана возможность введения их в организм через кожу и слизистые оболочки и т. п.

Ранние публикации, посвященные биологическим эффектам, производимым олигонуклеотидами, вызвали огромный интерес специалистов во всем мире. В 1988 г. в Академгородке был проведен первый в мире симпозиум по ген-направленным веществам на основе фрагментов нуклеиновых кислот. В работу по созданию подобных препаратов включились ученые США, Франции, а затем и других стран; возникли десятки компаний, поставивших перед собой цель создать терапевтические препараты на основе олигонуклеотидов.

Комплементарное лекарство

Первыми из препаратов ген-направленного действия стали так называемые антисмысловые олигонуклеотиды, предназначенные для избирательной инактивации вирусных РНК и некоторых клеточных РНК. Изначально предполагалось, что к этим олигонуклеотидам будут присоединены реакционно-способные группы, которые должны химически модифицировать или разрушать целевые нуклеиновые кислоты. Однако выяснилось, что присоединение олигонуклеотидов к РНК-мишени само по себе оказывает на нее настолько большое влияние, что может провоцировать ее разрушение клеточными ферментами.

Д. Г. КНОРРЕ - академик РАН, специалист в области химической кинетики, молекулярной биологии и биоорганической химии. Заведующий лабораторией химии природных полимеров (1960-1984 гг.), отделом биохимии и лабораторией химии нуклеиновых кислот (1970-1984 гг.) Института органической химии СО АН СССР, директор Института биоорганической химии СО АН СССР и СО РАН (1984-1996 гг.) Антисмысловые подходы, основанные на использовании нуклеотидов и нуклеиновых кислот для подавления биологической активности нуклеиновых кислот, сулят интересные перспективы в тех случаях, когда нужно задавить реализацию нежелательной информации в живых организмах. В первую очередь открывается перспектива создания нового поколения противовирусных и противоопухолевых препаратов. Такие препараты имеют одно неоспоримое преимущество перед другими… Все олигонуклеотиды независимо от мишени, на которую они нацелены, могут быть созданы по единой технологии. Варьировать нужно только последовательность нуклеотидов. В частно­сти, в вирусологии и онкологии часто приходится сталкиваться с таким явлением, как возникновение устойчивости к препаратам. Это происходит чаще всего потому, что у отдельной вирусной частицы или отдельной раковой клетки происходит мутация, приводящая к такой устойчивости. В любом другом случае нужно начинать эмпирический поиск нового лекарственного препарата. В случае антисмысло­вых воздействий нужно только определить, какое изменение в структуре вирусного генома или онкогена привело к появлению устойчивости. После чего сразу становится ясным, как по той же единой технологии создавать новый препарат *.

* Соросовский образовательный журнал. - 1998. - 12. - C. 25-31.

Самым мощным средством «выключения» генов оказались интерферирующие РНК - короткие двуцепочечные комплексы из РНК-олигонуклеотидов. Когда такой комплекс вводят в клетку, одна из цепочек связывается с комплементарной ей последовательностью в информационной РНК клетки. Это служит сигналом к началу работы группы ферментов, которые разрезают РНК, связанную с олигонуклеотидами. В результате программа синтеза определенного белка исчезает.

В 2006 г. за объяснение действия механизма РНК-интерференции два американских исследователя были удостоены Нобелевской премии по физиологии и медицине. Создание регуляторов экспрессии генов на основе интерферирующих РНК открыло большие возможности для получения широкого спектра высокоэффективных нетоксичных препаратов, подавляющих экспрессию практически всех, в том числе опухолевых и вирусных, генов.

Правильные мутации

Внимание специалистов давно привлекают и методы мутагенного воздействия на ДНК с помощью олигону­клеотидов или их производных. В случае успеха может стать реальным то, что сегодня кажется фантастикой: коррекция дефектных генетических программ.

Экспериментально уже доказано, что с помощью коротких олигонуклеотидов можно вносить в генетические программы точечные мутации. Как это осуще­ствить? Мутагенные олигонуклеотиды, содержащие «неправильные» нуклеотидные блоки, вводятся в клетку, где они соединяются с ДНК. В результате в некоторых участках нуклеотидных последовательностей появляются «неправильные», т. е. некомплементарные, пары оснований, что и воспринимается клеточной системой репарации («ремонта») ДНК как повреждение. Нуклеотиды в подобной паре заменяются репаративными ферментами таким образом, чтобы она стала «правильной», комплементарной. При этом замена может происходить как в олигонуклеотидной последовательности, так и в самой клеточной ДНК.

В последнем случае мы имеем дело с изменением генетической программы, т. е. с мутацией. И хотя эффективность подобного мутационного процесса в целом невелика, он может быть использован применительно к новым клеточным технологиям. Например, стволовые клетки больного с каким-либо наследственным нарушением можно обработать избирательным мутагеном, а затем отобрать те из них, в которых произошла нужная мутация (т. е. клетки с «исправленной» генетической программой), размножить и ввести в организм.

1967 г. Опубликована первая работа по олигонуклеотидам - ген-направленным биологически активным веществам

Таким образом, существующие на сегодняшний день олигонуклеотиды способны регулировать «работу» генов на различных уровнях. Так, вышеупомянутые антисмысловые олигонуклеотиды и интерферирующие РНК работают на стадии синтеза белка, воздействуя на матричные РНК - информационные молекулы, в которых происходит сборка полипептидных цепочек. Антигенные олигонуклеотиды, образующие комплексы с ДНК, подавляют экспрессию генов - образование самих матричных РНК, а олигонуклеотиды-аптамеры могут, подобно антителам, образовывать связи с определенными белками, блокируя их. Кроме того, некоторые олигонуклеотиды способны стимулировать работу иммунной системы - сегодня их используют в качестве компонентов вакцин.

В настоящее время разработку и синтез олигонуклеотидов и их аналогов ведут большие исследовательский и индустриальный секторы. Так, в прошлом году только объем рынка олигонуклеотидов, предназначенных для исследовательских целей, превысил 800 млн долларов! Сейчас разработаны и синтезированы десятки новых видов химически модифицированных олигонуклеотидов, идут испытания ряда противовирусных и противовоспалительных препаратов, полученных на их основе. Исследования подобного рода в России сейчас проводятся в основном в Институте химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН, где работают ученики и последователи академика Д. Г. Кнорре.

Вот так плодотворность идеи, возникшей в Сибирском отделении сорок лет назад, была доказана самой жизнью. Используя в качестве базовых структур для создания ген-направленных биологически активных веществ короткие фрагменты нуклеиновых кислот, можно быстро разработать и внедрить в производство специфические лекарственные препараты практически против любого вируса. Для этого необходимо лишь расшифровать нуклеотидную последовательность вирусных генов, что несложно сделать с помощью современных технологий. У этого универсального подхода большое будущее: результаты исследований последних лет, в частности по направленному мутагенезу, позволяют рассчитывать на появление в скором времени эффективных лекарств для борьбы с заболеваниями, до сих пор считающихся неизлечимыми.