Материнские клетки дрожжей жертвуют всем ради своего потомства. Цитоплазма и ее органоиды

Открытие своеобразной формы полового поведения у митохондрий совместимо с теорией симбиоза. Генетическая рекомбинация у этих органелл гораздо больше напоминает половой процесс у фагов и бактерий, чем у ядер эукариот. Все четкие данные получены на Saccharomyces, так как дрожжи могут размножаться в чистой культуре, на среде определенного состава, как стабильные гаплоиды или диплоиды. В таких митотически делящихся клетках ядерный геном остается неизменным, и это позволяет следить за сегрегацией рекомбинантной ДНК, образующейся при скрещиваниях между маркированными родительскими митохондриями. Рекомбинация митохондриального генетического материала происходит у дрожжей регулярно и часто независимо от мейоза.

Так как большинство других эукариот не переносит серьезных нарушений функционирования митохондрий и не может расти без полового процесса в виде одиночных гаплоидных или диплоидных клеток, генетическое поведение их митохондрий исследовать не удается. Однако если результаты, полученные на дрожжах, можно экстраполировать на другие эукариотические организмы, то рекомбинация митохондрий должна быть обычным явлением. Ваши собственные органеллы, возможно, ведут свою тайную половую жизнь.

Уже построена генетическая карта митохондрий дрожжей. Почти половина охарактеризованных митохондриальных мутаций затрагивает белоксинтезирующую систему этих органелл: они выражаются в изменении резистентности к антибиотикам, изменении транспортных и рибосомных РНК. Другие мутации влияют на комплексы дыхательных белков, связанные с мембраной. Известно около 700 независимо выделенных митохондриальных мутантов. Комментируя половое поведение митохондрий дрожжей, Б. Дюжон (личное сообщение, 1978) писал:

«Я полагаю, что следует с осторожностью применять термин «пол» по отношению к митохондриям, но при том определении, которое Вы ему даете [регулярное образование индивидуумов, имеющих более одного родителя], я полностью согласен с употреблением этого термина. Интактные митохондриальные геномы дрожжей рекомбинируют столь активно, что после недолгого [асексуального] роста [стабильно диплоидных родительских дрожжей, образующихся в результате спаривания] возникают всевозможные множественные рекомбинанты [митохондрий]. Но следует отметить, что рекомбинация может происходить и между разными молекулами митохондриальной ДНК, происходящими от одного родителя, а не только между молекулами от разных родителей. Под словом «пол» часто также понимают половую дифференциацию, и хотя мы всегда говорим о «гомосексуальных» и «гетеросексуальных» скрещиваниях, нет никаких данных о существовании среди митохондрий двух (или нескольких) половых типов. По нашей терминологии «половой тип» - это тип, способный рекомбинировать только с противоположным половым типом. Система омега (ω), контролирующая полярность рекомбинации вблизи самого омега-локуса, вначале была принята за половой тип. Теперь мы знаем, что различие между ω + и ω — связано с включением определенной нуклеотидной последовательности (около 1000 пар) в точно локализованный участок митохондриальной ДНК. Наконец, в сознании многих исследователей существует параллель между митохондриальной наследственностью и материнской наследственностью [митохондриальные генотипы передаются потомству только одним родителем, обычно самкой или родителем, продуцирующим яйца]. Все наши результаты указывают на то, что у дрожжей оба родителя вносят равный вклад в передачу митохондрий потомству независимо от их ядерных половых типов… а, следовательно, нет смысла говорить об эффекте материнской наследственности. У других видов это, очевидно, не так».

Рекомбинацию у митохондрий обычно изучают, используя маркеры резистентности к антибиотикам или мутации белков, участвующих в дыхании и окислительном фосфорилировании. Первые, например резистентность к аминогликозидным антибиотикам, которые, как известно, подавляют рост свободноживущих и патогенных бактерий, присоединяясь к их рибосомам, считаются мутациями, затрагивающими митохондриальные рибосомы. Вторые, называемые мутациями mit — , представляют собой дефекты митохондриальных генов, кодирующих такие белки, как цитохромоксидаза, олигомицин - чувствительная мембранная АТРаза, цитохром b и различные редуктазы. Биологические особенности дрожжей и большое число митохондриальных маркеров обусловили возможность многофакторных скрещиваний, в которых можно одновременно прослеживать передачу многих митохондриальных генетических детерминантов. Более чем десятилетняя работа ряда исследователей позволяет нарисовать интереснейшую картину митохондриального полового процесса. Нижеследующее резюме основано в первую очередь на работе Дюжона и Слонимского.

Митохондриальная генетическая система мультигеномна: каждая дрожжевая клетка содержит несколько идентичных копий функциональной митохондриальной ДНК. Их число не фиксировано. Число генетически активных копий может варьировать в разных клетках одного штамма дрожжей; оно зависит также от внешних условий, таких как температура и присутствие различных веществ, и от скорости роста дрожжей. Межштаммовые различия в числе митохондриальных геномов на клетку по крайней мере частично определяются несколькими взаимодействующими ядерными генами. Спаривание и рекомбинация митохондриальных ДНК, по-видимому, происходит часто и случайным образом. Рекомбинация нереципрокна; действительно, число двойных рекомбинантов в двухфакторных скрещиваниях всегда более чем вдвое (часто намного более) превышает ожидаемое на основании реципрокной модели. Продукты рекомбинации быстро сегрегируют при митотическом делении клеток; клетка, содержавшая вначале по-разному маркированные митохондрии, через несколько делений дает дочерние клетки с митохондриями только одного типа. Причина этой сегрегации, которая происходит без добавления каких-либо селективных агентов, не ясна. В некотором смысле это проявление внутриклеточного отбора, при котором остальная часть клетки - нуклеоцитоплазма - служит для митохондрий внешней средой. Показано, что внутриклеточный отбор может приводить к сегрегации некоторых маркеров резистентности к антибиотикам. По-видимому, небольшое число сегрегирующих митохондриальных генетических единиц, содержащихся в каждой дрожжевой клетке, распределяется при митотическом делении случайно. Каждая сегрегирующая единица, очевидно, состоит из нескольких молекул ДНК. Организация этой ДНК не вполне понятна, но наиболее правдоподобная гипотеза состоит в том, что сегрегирующая единица - это группа молекул митохондриальной ДНК, прикрепленных в определенном месте к внутренней мембране митохондрии. Это согласуется с данными электронной микроскопии.

Можно сформулировать следующие общие правила наследственной передачи и рекомбинации митохондриальных маркеров у Saccharomyces cerevisiae.

1. Передача двух или большего числа аллелей различных локусов, если они получены от одного родителя (дрожжевой клетки), всегда происходит коррелированно. Часто, но отнюдь не всегда, наблюдается линейная корреляция; если корреляция нелинейна, ее вид предсказывается моделью Дюжона и Слонимского.

2. Верхний предел частоты рекомбинации между двумя маркерами 20-25%. Этот предел может быть превышен только тогда, когда два реципрокных рекомбинанта появляются с существенно разной частотой. Такое явление получило название полярности рекомбинации. Если полярность высока, максимальная частота рекомбинации может достигать 80%, причем в этом случае число типов рекомбинантов намного больше числа родительских типов.

3. Существует нелинейное функциональное отношение между частотой рекомбинации между двумя локусами и передачей аллелей каждого локуса. Вид этого отношения предсказывается моделью Дюжона и Слонимского.

4. В трехфакторных скрещиваниях, когда отсутствует полярность рекомбинации, число двойных рекомбинантов по крайней мере вдвое больше ожидаемого, равного произведению частот появления двух одиночных рекомбинантов.

Эти четыре правила позволяют построить физическую и генетическую карту митохондриальной ДНК дрожжей. Все мутации, подчиняющиеся этим правилам, локализуются в одной группе сцепления, т. е. в одной молекуле митохондриальной ДНК. Митохондриальный геном состоит из уникальных нуклеотидных последовательностей, разделенных повторяющимися последовательностями. Имеется 60-70 уникальных генов со средней длиной 530 нуклеотидов; они чередуются с повторяющимися последовательностями средней длиной 680 нуклеотидов. Каждая повторяющаяся последовательность состоит из спейсера, богатого АТ (около 600 нуклеотидов), короткого кластера примерно из 30 нуклеотидов ж кластера, богатого GC, длиной около 50 нуклеотидов. Спейсеры, богатые АТ, вероятно, играют важную роль в рекомбинации; две другие последовательности в составе повторов могут, помимо прочего, регулировать инициацию синтеза ДНК.

Подводя итоги, можно сказать, что митохондрии дрожжей представляют собой мультигеномную генетическую систему, претерпевающую много циклов спаривания и характеризующуюся высокой эффективностью генетической рекомбинации и случайной, но очень быстрой сегрегацией. Этот своеобразный «промискуитет»» - случайность рекомбинаций и быстрота сегрегации - напоминает генетическое поведение бактериофагов.

Однако в других отношениях митохондриальная ДНК не похожа на фаговую. Например, близко родственные штаммы дрожжей могут сильно различаться по объему, содержанию митохондриальной ДНК, не различаясь при этом по функции митохондрий. У близких штаммов даже нуклеотидный состав митохондриальной ДНК может быть разным, так что значительная часть этой ДНК должна быть избыточной для функционирования генома. Кроме того, как и у эукариот, митохондриальные гены имеют мозаичную организацию. Иначе говоря, генетический материал, кодирующий разные участки одного и того же белка, может находиться в обособленных отрезках ДНК, и соответствующие транскрипты объединяются путем сплайсинга. Эти и другие черты генетической организации митохондрий привели Бернарди к следующему заключению:

«Можно сделать два основных вывода… Во-первых, митохондриальному геному дрожжей свойствен эукариотический, а не прокариотический тип организации… Во-вторых, в такой системе, как митохондриальный геном дрожжей, где чередуются уникальные и повторяющиеся последовательности, чрезвычайно важную роль играют рекомбинации, основанные на гомологии повторяющихся участков. Это основной механизм дивергенции и эволюции геномов, который обеспечивает на несколько порядков величины более высокую скорость этих процессов, чем механизм, основанный на точечных мутациях».

Бернарди, видимо, полагает, что генетическая организация митохондрий сформировалась таким образом, чтобы их эволюция могла происходить быстрее. Однако нам кажется, что, каково бы ни было значение всех этих фактов для симбиотической теории, было бы неразумно объяснять их, наделяя эволюцию способностью к предвидению.

В митохондриальной ДНК дрожжей обнаружено только 2 гена рибосомальной РНК и только 1 ген рибосомальных белков. Этот белок расположен в малой субъединице рибосомы. Ген рибосомального белка достаточно вариабелен по размерам даже у разных штаммов, за что и получил название вариабельного (Var l). Остальные белки и РНК митохондриальных рибосом кодируются ядерными генами. 24 гена транспортной РНК обеспечивают транспорт всех аминокислот к месту синтеза белка и только одна транспортная РНК, транспортирующая лизин, импортируется из цитоплазмы и кодируется ядром. Все транспортные РНК митохондрий дрожжей кодируются одной и той же нитью ДНК и только одна из них -- противоположной нитью. Ни один из генов транспортной ДНК не имеет интронов. Гены белков цитохрома b и гены белков цитохрома С могут иметь множество интронов -- от 5 до 9.

Из приведенных данных следует, что кодируемых митохондриальным геномом дрожжей структурных белков явно недостаточно для функционирования этих органелл и большая часть из них кодируется ядерным геномом.

Характерные черты организации и экспрессии митохондриального генома грибов:

1. значительное разнообразие в наборах и расположении митохондриальных генов у различных видов;

большое разнообразие способов организации генетического материала - от компактной организации генома до свободного распределения генов по мтДНК при протяжённых некодирующих последовательностях между генами;

• 3. мозаичное строение ряда генов;
• 4. значительные внутривидовые вариации размеров мтДНК, связанные с наличием "необязательных" интронов;
• 5. способность отдельных сегментов мтДНК к выщеплению и амплификации с образованием дефектного митохондриального генома;
• 6. наличие одного или нескольких ORI, в каждом из которых репликация инициируется двунаправлено;
• 7. расположение всех митохондриальных генов на одной нити мтДНК и асимметричная транскрипция мтДНК;
• 8. множественность транскрипционных единиц мтДНК;
• 9. разнообразие сигналов процессинга первичных транскриптов, в качестве которых могут использоваться и тРНК, и олигонуклеотидные блоки другого типа - в зависимости от вида;
• 10. в большинстве случаев мРНК содержат протяжённые концевые некодирующие последовательности.

Наиболее сложная организация митохондриального генома у высших растений. У них митохондриальный геном представляет собой набор суперскрученных двуцепочечных кольцевых и/или линейных молекул. Все последовательности митохондриального генома могут быть организованы в одну крупную кольцевую «хромосому», а наблюдаемые различные размерные классы митохондриальных ДНК, скорее всего, являются результатом рекомбинационных процессов. По крайней мере, на шпинате, видах двух родов Brassica и Raphanus , сахарной свекле и пшенице было показано, что причина такой диспергированности митохондриального генома заключается в рекомбинации гомологичных участков митохондриальной ДНК. Благодаря наличию прямо ориентированных двух-трех семейств повторов размером от 1 до 14 т.п.н., молекулы митохондриальной ДНК способны к активным меж- и внутригеномным перестройкам. В результате таких перестроек митохондриальная ДНК может присутствовать в виде молекул различного размерного класса.

Так, например, у крестоцветного Brassica campestris митохондриальная ДНК присутствует в виде кольцевых молекул трех типов. Первый тип содержит полный геном -- 218 т.п.н., второй - 135 и третий -- 83 т.п.н. Субгеномные кольца образуются в результате рекомбинации геномных колец, имеющих пару прямых повторов длиной 2 т.п.н.

У пшеницы размер митохондриального генома значительно больше -- 430 т.п.н., и имеется более 10 прямых рекомбинационных повторов, в результате при электронно-микроскопическом наблюдении удается увидеть множество колец различного размера, но никто не наблюдал одну большую кольцевую молекулу, возможно, в этом состоянии митохондриальный геном пшеницы никогда и не присутствует. У мха маршанции и другого крестоцветного Brassica hirta прямые рекомбинационные повторы отсутствуют и, возможно, именно поэтому митохондриальная ДНК находиться в виде кольцевых молекул одного размерного класса. Однако для митохондриальной ДНК высших растений это скорее исключение, чем правило. У большинства высших растений в митохондриальном геноме присутствуют как рекомбинационные повторы, так и молекулы митохондриальной ДНК различного размерного класса.

Количество молекул одного размерного класса может различаться очень значительно в различных тканях растения, в зависимости от состояния растений и условий окружающей среды. Отмечено изменение численных соотношений молекул митохондриальной ДНК разного размерного класса при культивировании растений in vivo и in vitro . Возможно, изменение численных отношений между молекулами различных размерных классов отражает адаптивность растений путем повышенной амплификации нужных генов.

Кроме того, в митохондриальной геноме могут присутствовать и плазмиды как линейные, так и кольцевые, как с ДНК-ми, так и РНК-ми последовательностями, размером от 1 до 30 т.п.н. Митохондриальные плазмиды, вероятно, произошли от других клеточных геномов или даже других организмов. Иногда их наличие или отсутствие удается связать с цитоплазматической мужской стерильностью растений, но, правда, не всегда. Плазмиды у некоторых видов присутствуют, а стерильности не наблюдается. По крайней мере, в одном случае достаточно четко продемонстрировано, что в митохондриях линий с так называемым S-типом стерильности кукурузы обнаружена корреляция между присутствием плазмидоподобной митохондриальной ДНК и проявлением феномена цитоплазматической мужской стерильности. Была отмечена способность митохондриальных плазмид встраиваться, как в геном митохондрий, так и в хромосомы ядра. Однако, в других случаях присутствие плазмидной ДНК не всегда вызывает стерильность пыльцы.

Размер митохондриального генома растений наиболее вариабелен -- от 200 до 2500 т.п.н. Размер митохондриального генома высших растений больше, чем размер их хлоропластного генома.

Значительное варьирование размеров митохондриального генома является второй особенностью митохондриального генома растений. Геном не только очень велик, но и может быть различным, даже у близкородственных видов, причем в одних случаях может наблюдаться низкая вариабельность -- виды рода Brassica , в других -- очень большая. Самая высокая вариабельность размеров наблюдается у тыквенных. В пределах этого семейства размер митохондриального генома наиболее изменчив -- от 330 т.п.н. у арбуза до 2500 т.п.н. у дыни. Поэтому доля митохондриальной ДНК в общем объеме генома растений также может значительно изменяться -- порядка 1 % у большинства растений, до 15 % в клетках гипокотиля дыни.

Наличие у митохондриальных геномов больших размеров пытаются объяснить различными причинами.

Наличие дополнительных генов или особых последовательностей, необходимых для функционирования митохондрий.

Присутствие ДНК, которая используется растением, но не в качестве кодирующей, а какой-то другой функции.

ДНК, которая не используется для функционирования митохондрий, так называемая «эгоистичная» ДНК.

По-видимому, существует еще одна возможность для увеличения размеров митохондриального генома -- это последовательности, гомологичные ядерной и хлоропластной ДНК. Последовательности, гомологичные ядерной ДНК, например, у арабидопсис составляют до 5 % митохондриального генома. Первоначально последовательность хлоропластного генома, инкорпорированная в митохондриальный, была обнаружена у кукурузы. Она включала участок около 14 т.п.н., содержащий измененные хлоропластные гены 16S-рибосомальной РНК и участок большой субъединицы РДФК/О. Впоследствии хлоропластные вставки были обнаружены в митохондриальном геноме многих видов высших растений. Обычно, они составляют 1 -- 2 % от митохондриальных последовательностей и включают три главные последовательности.

Последовательность длиной 12 т.п.о. из обратного повтора хлоропластной ДНК. Она содержит последовательности для 3" экзона четырех транспортных РНК и последовательность 16 S рибосомальной РНК.

Последовательность длиной от 1,9 до 2,7 т.п.н., которая полностью кодирует большую субъединицу РБФК/О.

Последовательность длиной не более 2 т.п.о. В хлоропластом геноме этот участок кодирует 3" -- конец 23S-pибоcoмальной РНК, 4,5S- и 5S-pPHK, а также три транспортные РНК. Из всех последовательностей хлоропластного генома, которые присутствуют в митохондриальном геноме растений, только последовательности транспортной РНК действительно транскрибируются.

Поскольку у многих видов растений в митохондриальном геноме присутствуют одни и те же хлоропластные последовательности, можно предположить, что они имеют какое-либо функциональное значение. В то же время их роль, механизм переноса и время этого переноса остаются неизвестными. Произошел ли этот перенос в отдаленное в эволюции время становления эукариотической клетки или же наличие хлоропластных вставок в митохондриальном геноме свидетельствует о том, что это нормальный процесс обмена информации между органеллами, происходящий и сейчас, либо он происходит периодически в относительно недавнем эволюционном времени становления конкретных видов и родов растений?

Кроме того, часть последовательностей митохондриального генома представляет собой последовательности, гомологичные вирусным.

Для установления числа генов в геноме митохондрий растений, которые действительно функционируют, рядом исследователей было определено количество продуктов трансляции. Было показано, что число обнаруживаемых белковых полос было одинаковым даже для растений с 10-кратными различиями по величине генома. Хотя использованные методы и не дают прямого ответа на вопрос об общем числе генов митохондриального генома, тем не менее, интересно, что одно и то же число продуктов трансляции было выявлено у анализируемых видов покрытосеменных и было близко к числу генов, кодирующих белки у митохондрий животных и дрожжей.

Впервые полная нуклеотидная последовательность митохондриальной ДНК у растений была определена в 1986 г. у одного вида -- маршанции (Marchantia polymorpha ), а позже у арабидопсиса и у нескольких видов водорослей.

Молекула митохондриальной ДНК у маршанции имеет размер 186 608 п.н. Она кодирует гены 3 рРНК, 29 генов для 27 тРНК и 30 генов известных функциональных белков (16 рибосомальных белков, 3 субъединицы цитохром С оксидазы, цитохрома b, 4 субъединицы АТФ-синтетазы и 9 субъединиц НАДН-дегидрогеназы). Геном также содержит 32 неидентифицированные открытые рамки считывания. Кроме того, обнаружено 32 интрона, расположенных в 16 генах. У разных растений количество генов того или иного комплекса может варьировать, поскольку один или более генов этого комплекса могут быть перенесены в ядро. Среди неидентифицированных генов, по крайней мере, 10 постоянно встречаются практически у всех видов растений, что свидетельствует о важности их функций.

Число митохондриальных генов, кодирующих транспортные РНК митохондрий растений, в значительной степени изменчиво. У многих видов собственных митохондриальных транспортных РНК явно недостаточно, и поэтому они экспортируются из цитоплазмы (кодируются ядром или пластидным геномом). Так, например, у арабидопсиса 12 транспортных РНК имеют митохондриальное кодирование, 6 -- хлоропластное и 13 -- ядерное; у маршанции 29 -- митохондриальное и 2 -- ядерное, и ни одна из транспортных РНК не имеет хлоропластного кодирования; у картофеля 25 -- митохондриальное, 5 -- хлоропластное и 11 -- ядерное; у пшеницы, 9 -- митохондриальное, 6 -- хлоропластное и 3 -- ядерное (табл. 3).

В отличие от митохондриальной ДНК животных и хлоропластных генов, гены митохондриальной ДНК растений дисперсно распределены в геноме. Это касается как генов, кодирующих транспортные РНК, так и генов, кодирующих белки.

Таблица 3

Природа митохондриальных транспортных РНК у растений

Как и геном митохондрий грибов, геном митохондрий растений имеет интроны, которых не имеют геномы митохондрий животных.

У некоторых видов ряд генов в геноме продублирован. Так, у кукурузы и кормовых бобов гены рРНК не повторены, а у пшеницы они повторены несколько раз. Гены, кодирующие белки митохондрий, также могут быть повторены в их геноме.

Естественно, что митохондрии так же, как и хлоропласты, содержат гораздо больше белков-ферментов, чем их геном генов. И, следовательно, большинство белков контролируются ядерным геномом, собираются в цитоплазме на цитоплазматических, а не на митохондриальных рибосомах и транспортируются в митохондриальные мембраны.

Таким образом, митохондриальный геном растений представляет собой крайне изменчивую по структуре, но достаточно стабильную по числу генов систему. В отличие от компактного генома хлоропластов, в митохондриальном геноме растений гены составляют менее 20 % генома. Увеличение генома митохондрий по сравнению с грибами или животными вызвано наличием интронов, различных повторяющихся последовательностей, вставок из генома хлоропластов, ядра и вирусов. Функции примерно 50 % митохондриального генома растений пока не выяснены. Кроме того, что многие структурные гены, контролирующие функцию митохондрий, находятся в ядре, там же находятся и многие гены, контролирующие процессы транскрипции, процессинга, трансляции митохондриальных генов. Следовательно, митохондрии являются даже менее автономными органеллами, чем пластиды.

). Снаружи дрожжевые митохондрии отграничены от цитоплазмы наружной двуслойной мембраной , оба слоя которой либо непосредственно соприкасаются друг с другом, либо разделены осмиофобным пространством. Изнутри наружную мембрану выстилает внутренняя мембрана . Она образует выступы - тубулы и или настоящие кристы, чаще всего пузырчато-трубчатого строения, достигающие 150-200 А в толщину и состоящие из двух осмиофильных слоев, разделенных пространством в 50-100 А. Кристы могут идти неравномерно во всех направлениях и не обязательно параллельно длинной оси митохондрий, как это сообщалось первыми исследователями. Внутреннее пространство между кристами заполнено матриксом, который, как правило, менее плотен, чем окружающая органоид цитоплазма. Новая информация о некоторых деталях строения митохондриальной структуры была получена при использовании недавно развитой техники негативного контрастирования и скалывания замороженных образцов (freeze- etching), обеспечивающих высокое разрешение и стабильность препаратов. Метод негативного контрастировапия позволяет воссоздать трехмерную пространственную структуру дрожжевых митохондрий. На микрофотографии ( рис. 2) отчетливо видна ограничивающая внешняя мембрана и находящиеся под ней складки внутренней мембраны, расходящиеся под разными углами. Кроме того, с помощью метода негативного контрастирования фосфорно- вольфрамовой кислотой была обнаружена новая субструктура дрожжевых митохондрий - регулярно расположенные мелкие грибовидные образования, покрывающие всю свободную поверхность внутренней мембраны и крист, обращенную в матрикс митохондрий (см. рис. 3). Детальное рассмотрение ультраструктуры частиц показывает, что каждая состоит из головки сферической формы с d=70-80 А, стебля длиной 45-50 А и шириной 20-40 А и базальной части, представляющей собой сегмент внутренней мембраны митохондрий. Аналогичные структуры найдены в митохондриях из других источников и, по- видимому, характерны для всех мембран, катализирующих окислительное фосфорилирование. Особенно плодотворным для изучения ультратонкой структуры дрожжевых митохондрий оказался метод фиксации клеток замораживанием [см. Фихше ea 1973 , Фихше ea 1973 ]. Модификации этого метода, основанные на сверхбыстром замораживании клеток с последующим нанесением реплик на обнаженные поверхности [см. Фихше ea 1973 , Фихше ea 1973 ], позволили выявить детали, не распознаваемые с помощью обычных методов фиксации. Так, с помощью этого метода показано, что митохондриальные мембраны содержат глобулярные частицы, упаковка которых носит уникальный характер. Слой внешней мембраны, прилегающий к цитоплазме, имеет характерную шероховатую поверхность и содержит перфорации ("поры") нерегулярного устройства, что предполагает возможность контакта между цитоплазмой и перимитохондриальным пространством. При протравливании препаратов парами платины на этой поверхности обнаруживаются многочисленные более мелкие, чем перфорации, частицы [см. Котельникова ea 1973 ]. Поверхности внешней и внутренней мембраны, разделенные незначительным пространством или примыкающие друг к другу, относительно гладкие и содержат лишь рыхло упакованные частицы. На поверхности внутренней мембраны, обращенной к матриксу, четко выявляются глобулярные, относительно плотно упакованные частицы, сопоставимые по своим размерам с теми, что видны при негативном контрастировании. Новые структурные элементы обнаружены и в матриксе. Они имеют форму непрерывной фиброзной сети с нерегулярными плотно упакованными гранулами и областями с концентрацией полос или борозд, представляющих собой, вероятно, также плотно упакованные частицы [см. Фихше ea 1973 , Фихше ea 1973 ].

Результаты структурного анализа хорошо коррелируют с биохимическими доказательствами локализации в матриксе высокополимерной ДНК и сложно организованных полиферментных комплексов и с данными о различном составе и функциональной нагрузке внешней и внутренней митохондриальных мембран (см. разд. 1.3). Как правило, митохондрии дрожжей содержат меньше крист и имеют тенденцию к нерегулярности в очертаниях, устройстве, форме и упаковке их, т. е. характеризуются менее упорядоченной и жесткой структурой, чем более сложные митохондрии высших организмов. Внутренняя митохондриальная мембрана варьирует от настоящих крист до тубулей и обнаруживает удивительную вариабельность в структурных деталях в зависимости от специфики обмена, условий культивирования и фазы роста дрожжевых клеток. Дрожжи с ярко выраженным аэробным типом обмена - облигатные аэробы и слабо бродящие факультативные анаэробы - отличаются развитым мембранным аппаратом и содержат большое число сложно структурированных митохондрий с многочисленными кристами. У бродящих видов дрожжей мембранный аппарат выражен слабо, имеются лишь немногочисленные крупные митохондрии с неправильно ориентированными кристами; у дрожжей низового брожения кристы рудиментируются. Однако следует подчеркнуть, что тонкая структура митохондрий не остается постоянной даже у одного и того же организма (особенно у факультативных анаэробов), а меняется в зависимости от физиологического состояния, фазы роста и условий культивирования. Поэтому перечисленные выше характерные морфологические особенности относятся лишь к вполне "сформировавшимся" митохондриям в клетках, собранных в поздней экспоненциальной или стационарной фазах роста. Те же клетки в экспоненциальной фазе роста или при выращивании на среде с высокой концентрацией глюкозы обладают немногочисленными митохондриями со сравнительно простой внутренней организацией. Нередко полиморфизм митохондрий можно наблюдать даже в пределах одной клетки. Еще большая вариабельность отмечена для формы и размеров митохондрий. И это неудивительно, так как функционирование митохондриального аппарата, как известно еще из прижизненного наблюдения с использованием цейтраферной съемки, происходит в условиях его непрерывной подвижности, сопровождающейся изменением размеров и форы. В процессе движения митохондрии могут собираться в крупные агрегаты или, наоборот, распадаться на более мелкие образования. Характерная ориентация и направленное движение митохондрий, иногда сопровождающиеся агрегацией в специфические формы, происходит при делении и почковании дрожжевых клеток.

Однако обнаружение актина в митохондриях [ Ethoh ea 1990 ] и подавление антагонистами кальмодулина , зависимого от дыхания набухания митохондрий, дает основание полагать, что некоторые функции подвижности митохондрий могут контролироваться эндогенными (собственными) Са2+ зависимыми системами.

Форма и размеры. Клетки дрожжей имеют разнообразную форму: круглую, овальную или эллиптическую, лимонообразную, цилиндрическую, иногда сильно вытянутую в виде гифов.

По сравнению с другими микроорганизмами дрожжи являются довольно крупными формами. Диаметр клеток дрожжей достигает 1-8 мкм, длина- 1-10 мкм. При таких размерах клеток поверхность их в 1 л сбраживаемого виноградного сока может достигать 10 м2. Именно такая большая поверхность клеток дрожжей определяет интенсивность их метаболизма и процесса обмена веществ с окружающей средой. Масса дрожжевых клеток, равнозначная по массе животному (500 кг), за сутки синтезирует более 50 т белка, а животное - всего около 0,5 кг.

Плотность (удельный вес) клеток дрожжей мало отличается от плотности бактериальных клеток. Относительная плотность бактериальных клеток составляет от 1,050 до 1,112; дрожжевых - от 1,055 до 1,060 .

Морфологически неизменные формы клеток дрожжей наблюдаются только у молодых культур на стандартной питательной среде. Одна и та же культура дрожжей может состоять из кле-

ток, различающихся по форме и размерам, особенно в зависимости от стадий развития и условий окружающей среды. Так, хересные дрожжи в период брожения, как правило, крупные, имеют эллиптическую или круглую форму клеток, тогда как в стадии образования пленки они становятся мельче, приобретают более вытянутую конфигурацию . Дрожжи рода Hansenula, обычно образующие пленку на поверхности вина из скоплений клеток сильно вытянутых, мелких, при развитии в среде с ограниченным доступом воздуха, например на дне бутылки, становятся крупнее, круглой формы. Форма и величина клеток дрожжей при введении СО2 в среду значительно изменяется. Размеры клеток пивных дрожжей (Sacch. carlsbergensis) увеличиваются и„ наоборот, клетки слабо бродящих дрожжей (Torula latvica) становятся значительно мельче .

Структура. Клетка дрожжей имеет сложное строение и состав. Размеры отдельных элементов ее находятся за пределами разрешающей способности светового микроскопа. Значительные успехи, достигнутые в настоящее время в расшифровке структур клетки дрожжей и их функций, основаны на новых методах исследования - электронной микроскопии и комплексной цитологии.

Дрожжевая клетка является одноклеточным микроскопическим организмом и имеет в основном то же строение, что и клетки животных и растений (рис. 16, 17). Внутри клетки содержатся компоненты, которые обычно подразделяются на органеллы и включения. К органеллам относятся клеточная оболочка, цитоплазматическая мембрана, цитоплазма, митохондрии, вакуоли, аппарат Гольджи, ядро. Включения - это временные образования клетки (гликоген, трегалоза, жир, метахроматин и др.К которые появляются и исчезают в процессе обмена веществ.

Клеточная оболочка - плотная, тонкая и эластичная, окружает цитоплазму и придает характерную форму клетке дрожжей, защищает ее от вредных факторов среды, несет электрический заряд. Оболочка поддерживает внутриклеточное осмотическое давление, регулируя поступление в клетку через поры солей и других низкомолекулярных соединений.

В химический состав клеточной оболочки входят белково-нолисаха-ридные комплексы, фосфаты и липиды. У Sacch. cerevisiae полисахаридная часть комплекса состоит примерно из равных количеств глю-кана и маннана, сумма которых составляет около 90% от сухой массы оболочки; остальное количество ее приходится на долю белка, липидов, глюкозамина . Белковые комплексы насыщены дисульфидными и сульфгидрильными группами. Липиды в основном (примерно на 2/3) состоят из свободных жирных кислот (олеиновой, пальмитолеиновой, пальмитиновой и стеариновой); остальную часть их представляют триглицериды, стерины и фосфолипиды.

В клеточных оболочках других видов дрожжей содержится глюкан, который не всегда связан с маинаном. Маннан может содержаться в клеточных оболочках дрожжей в небольших количествах (Sacch. guttulata и Endomycopsis capsularis), или совсем отсутствовать (Nadsonia fulvescens, Schizosaccharomyces). Оболочки клеток дрожжей, лишенные маннана, за исключением видов рода Schizosaccharomyces, содержат повышенные количества хитина.

В области периплазмы, которая находится между внутренней поверхностью клеточной оболочки и внешней поверхностью цитоплазматической мембраны, найден ряд ферментов. В основном это гидролитические ферменты, в том числе (3-фруктофуранози-даза (инвертаза) и кислая фосфатаза.

Обычно с составом клеточной оболочки связывают явление хлопьеобразования (флокуляции) дрожжей. Для дрожжей, так же как и для бактерий, установлено, что переход S-форм (гладких) в R-формы (шероховатые) и образование хлопьев в жидкой среде обусловлены превращением гидрофильных групп клеточной оболочки в гидрофобные . Однако анализ клеточных оболочек дрожжей, выделенных из хлопьеобразующих и нехлопьеобразующих штаммов Sacch. cerevisiae и Sacch. carls-bergensis, выращенных на синтетической среде, не выявил значительных различий в содержании основных компонентов, хотя по мере роста как у тех, так и у других количество маннана постепенно уменьшалось, а глюкана - увеличивалось. И лишь активная связь фосфоманнана и ионов кальция у двух соседних хлопьеобразующих клеток дрожжей может служить объяснением явления флокуляции .

Электронно-микроскопически также не обнаружены какие-либо особенности клеточных оболочек у флокулирующих дрожжей. По-видимому, эффект флокуляции дрожжей обусловлен наследственностью штамма.

Цитоплазматическая мембрана образует наружный слой цитоплазмы. Она окружает протопласт - отдельную структурную фракцию клетки, которую можно получить при удалении клеточной оболочки с помощью ферментов. Цитоплазматическая мембрана состоит из разных по плотности электронных слоев общей толщиной не более 10 нм тесно связанных с цитоплазмой. При микроскопировании в темном поле мембрану можно наблюдать в виде тонкого светящегося ободка.

В клетке микроорганизма цитоплазматическая мембрана осуществляет 4 основные функции : действует как осмотический барьер, регулирует проникновение питательных веществ из раствора в клетку и удаление продуктов обмена веществ, выполняет биосинтез некоторых составных частей клетки (компонентов клеточной оболочки), представляет собой место локализации некоторых ферментов и органелл (рибосомы).

Поступление (транспорт) веществ в клетку связано с изменением проницаемости мембраны, которая в свою очередь зависит от активности фосфолипазы и липазы .

Цитоплазма клетки дрожжей содержит все основные структуры, присущие высокодифференцированным клеткам, а именно: митохондрии, рибосомы, более или менее развитый эндоплазматический ретикулум (эндоплазматическая сеть), запасные вещества и другие внутриклеточные включения липоидной и углеводной природы. Они принимают активное участие в осуществлении важных ферментативных процессов в цитоплазме.

В результате электронно-микроскопических и биохимических исследований установлено, что цитоплазма представляет собой коллоидную систему, состоящую из белков, углеводов, липидов, минеральных веществ, воды и соединений других видов. По консистенции она характеризуется высоким показателем вязкости, превышающим вязкость воды в 800-8000 раз, что соответствует вязкости глицерина или густого сиропа. Вязкость цитоплазмы при старении клеток возрастает.

Структура цитоплазмы изменяется в зависимости от условий культивирования и возраста клетки. Изменения цитоплазмы могут быть обратимые (паранекроз) и необратимые (некротические), что обусловлено степенью воздействия внешних факторов. У молодых клеток дрожжей цитоплазма гомогенна; при старении появляются вакуоли, зернистость, жировые капельки, гранулы полифосфатов и липоидов, т. е. цитоплазма становится гетерогенной.

При длительном дифференциальном центрифугировании цитоплазма делится на растворимую фракцию (клеточный сок) и на фракцию частиц, состоящую из мембран и рибосом. Растворимая фракция, заполняющая пространство между частицами в пнтактной клетке, является основным компонентом, который обеспечивает взаимодействие метаболитов с той средой, где находятся и функционируют структурные элементы. В растворимой фракции содержатся вещества с высокой молекулярной массой, преимущественно ферменты и транспортная РНК (тРНК), а также низкомолекулярные соединения, к которым относятся запасные углеводы, например, трегалоза и фонд (пул) аминокислот и нуклеотидов . В результате наличия в цитоплазме низкомолекулярных соединений возникает заметная разность в осмотическом давлении клеточного содержимого и наружной среды. Величина осмотического давления у дрожжей обычно составляет около 1,2 МПа .

Электронно-микроскопические исследования ультратонких срезов клеток показали, что цитоплазму пронизывает эндоплаз-матическая сеть (ретикулум), имеющая гранулярную или гладкую структуру. Тесный контакт ретикулума с другими компонентами клетки позволяет ему выполнять важную роль в обменных процессах клетки.

Одним из компонентов эндоплазматического ретикулума являются рибосомы. Это ультрамикроскопические плотные сферические гранулы. Они содержат почти равное количество РНК. и белка, незначительное - липидов. С функциональной особенностью рибосом связан синтез клеточных белков. На них происходит конденсация активированных аминокислот и укладка их в полипептидную цепь в соответствии с генетической информацией, переданной из ядра через информационную РНК .

Митохондрии - это высокоспециализированные обязательные мельчайшие органеллы дрожжевой клетки. Они обычно распределены равномерно между клеточной оболочкой и вакуолью. Их можно обнаружить не только в покоящихся клетках дрожжей, но и в клетках почкующихся, находящихся на различных стадиях роста и размножения, в почках и спорах. В монографии А. В. Котельниковой и Р. А. Звягильской «Биохимия дрожжевых митохондрий» рассмотрена подробно структурно-функциональная организация дрожжевых митохондрий.

Форме и размерам дрожжевых митохондрий присуща изменчивость. Длина их у различных дрожжевых организмов составляет от 0,2 до 7,5 мкм. По форме они могут быть в виде небольших гранул, палочек, нитей, цепочек.

Обычно число митохондрий в клетке колеблется от одной да 50. Но даже если в клетке присутствует всего одна митохондрия, она занимает не менее 20% объема клетки. В дрожжах Sacch. cerevisiae объем этих органелл может достигать 80% объема всей клетки. При низкой концентрации глюкозы в среде дрожжевая клетка содержит 100-200 митохондрий, при высокой - 30-40.

Митохондрии совершают свои функции при непрерывном перемещении с изменением размеров и формы, характеризуются быстротой и специфичностью реакции на изменения условий культивирования и физиологического состояния клетки.

Митохондрии отделены от цитоплазмы наружной двухслойной мембраной. Внутренняя мембрана образует выступы-кристы, чаще всего пузырчато-трубчатого строения. Пространство между кристами заполнено гомогенным веществом - матриксом. Слой внешней мембраны митохондрий, прилегающий к цитоплазме, имеет шероховатую поверхность и содержит перфорацию нерегулярного устройства.

Факт обязательного присутствия митохондрий в структуре клетки свидетельствует о локализации в них особых процессов, важных в обмене веществ. Дрожжевые митохондрии состоят главным образом из липидов - около 30% и белков - 65-70% сухой массы митохондрий, из которых около 25-35% находятся в форме структурного белка.

Дрожжевые митохондрии содержат ферменты, которые обеспечивают выполнение основной энергетической функции (окисление субстратов в цикле Кребса, перенос электронов через дыхательную цепь и окислительное фосфорилирование) - участвуют в сложном механизме воспроизведения митохондриальной ДНК, транскрипции и трансляции генетической информации, в биосинтезе фосфолипидов стеринов, в активации жирных кислот и др. Дезоксирибонуклеиновая кислота (ДНК) и рибонуклеиновая кислота (РНК) составляют количественно небольшой структурный компонент митохондрий.

Одним из наиболее значительных достижений молекулярной биологии последних лет считают обнаружение в митохондриях специфической ДНК . Митохондриальная ДНК (мДНК) существенно отличается от ядерного компонента ДНК клетки.

Вакуоли в дрожжевых клетках являются обязательным органоидом. Кроме растворенных в воде электролитов, в вакуолях содержатся в коллоидном состоянии белки, жиры, углеводы и ферменты. В вакуолях накапливаются: Na, К, Са, Mg, Cl, SO4 и РО4 в виде отдельных элементов и солей, причем концентрация их во много раз превышает содержание солей в окружающей среде .

Размеры и форма вакуолей в дрожжевых клетках подвержены значительным изменениям. В одной дрожжевой клетке их может быть или несколько, или одна - центральная вакуоль.

Вакуоли содержат разнообразные включения как в состояли раствора, так и в форме кристаллических или аморфных гранул и капель; pH сока вакуоли 5,9-6,0; осмотическое давление составляет величину, близкую осмотическому давлению 2,5- 3,5%-ных растворов хлористого натрия. Содержимое вакуоли обычно оптически пусто. Светятся лишь кристаллические и липо-идные включения, находящиеся в энергичном броуновском движении. В вакуолях протекают активные окислительно-восстановительные процессы .

Аппарат Гольджи (диктиосома) состоит из ряда двойных мембран, концентрически изогнутых. Иногда от концов мембран отшнуровываются круглые пузырьки, которые могут затем превращаться в крупные вакуоли. Считают, что функция аппарата Гольджи заключается в управлении общим ходом физиологических процессов.

Ядро является постоянным структурным компонентом дрожжевой клетки. В живых дрожжах ядра можно отчетливо наблюдать в клетках, пробывших несколько дней в стерильной воде, цитоплазма которых вследствие голодания становится более гомогенной и прозрачной, а также при флуоресцентной микроскопии после обработки дрожжевых клеток растворами флуоро-хромов и при фазово-контрастной микроскопии.

Ядро у дрожжей имеет оболочку, ядрышко (кариосому) и основное содержимое - кариоплазму. Оболочка принимает участие в регуляции внутриядерных процессов путем изменения проницаемости и непосредственных сообщений между ядром и внеклеточной средой и ядром и цитоплазмой .

Диаметр дрожжевого ядра около 2 мкм, чаще всего ядра имеют шаровидную или эллиптическую форму. Расположение их может меняться в процессе жизнедеятельности клетки.

Размеры дрожжевого ядра неодинаковы не только в клетках различных родов, но и в клетках одной и той же культуры при разном физиологическом состоянии. Крупные ядра с отчетливой кариосомой наблюдаются у дрожжей представителей родов Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Saccharomycodes. В противоположность им клетки, принадлежащие к слабо бродящим и небродящим дрожжам (Torulopsis pulcherrima, Т. utilis), имеют обычно относительно мелкие ядра. У растущих дрожжевых клеток ядра обогащаются нуклеиновыми кислотами и часто перемещаются в активные участки роста ближе к участкам, в которых происходит почкование или деление клеток.

Основным химическим ингредиентом ядра является ДНК. С нею и только с нею связана передача генетической информации от одного поколения клеток к другому. В состав ядра обязательно входит также РНК, но обычно в меньшем количестве, чем ДНК- Ядро содержит и белки, не связанные с нуклеиновыми кислотами. Молекулами ДНК и РНК обусловливаются синтез и особенности белков клетки. Поток генетической информации направлен от ДНК через РНК к белку (ДНК->РНК-белок).

0,18-0,17% в расчете на сухую биомассу. Содержание ДНК в дрожжевых клетках винных дрожжей после термической обработки почти не изменяется .

Нуклеотидный состав ДНК весьма специфическим образом зависит от вида организма. Однако число остатков аденина равно числу остатков тимина (т. е. А=Т), а число остатков гуанина равно числу остатков цитозина (Г = Ц), т. е. число пиримидиновых остатков равно числу пуриновых остатков (А + Г = Т + Ц). Близкие виды дрожжей имеют сходный нуклеотидный состав, а эволюционно отдаленные организмы весьма заметно различаются по этому показателю. Поэтому часто нуклеотидный состав ДНК используют как таксономический признак .

При размножении клеток в ядрах обнаруживаются структуры, содержащие ДНК,- хромосомы, которые у дрожжей можно видеть иногда на фиксированных препаратах при окраске . В хромосомах ДНК, связанная с белками-гистонами, образует нуклеопротеидные нити толщиной около 10 нм . Для конкретного вида дрожжей число хромосом, длина и форма их постоянны.

Однако данные о числе хромосом у дрожжей весьма противоречивы и пока не подкрепляются ни результатами электронномикроскопических исследований, ни генетическими данными .

В определенных условиях в природе и в эксперименте при воздействии различных химических и физических агентов число хромосом в клетке может изменяться. У гаплоидных клеток набор хромосом одинарный (п), у диплоидных - двойной (2 п). С увеличением числа хромосомных наборов возрастает содержание ДНК, увеличиваются размеры клетки, ее ядра и ядрышка. Гаплоидные клетки содержат точно половину того количества ДНК, которое обнаруживается в диплоидных.

Внутриклеточные включения и запасные вещества, находящиеся в цитоплазме и вакуолях клеток в процессе их жизнедеятельности,- это морфологически дифференцированные образования гранул гликогена, метахроматина (волютина), жироподобных веществ и капель жира, скоплений серы, кристаллов кислот и сахаров. Они находятся в клетке в осмотически инертной форме, обычно нерастворимы в воде.

Трегалоза (нередуцирующий дисахарид) и гликоген (полисахарид) содержатся в клетке в значительных пределах: трегалоза - от 20 до 150 мг, гликоген - от 30 до 100 мг на 1 г сухих веществ клеток. В дрожжах, выращенных в аэробных условиях, преобладает трегалоза, в то время как в дрожжах, взращенных анаэробно,- гликоген. С повышением температуры среды количество трегалозы в клетках увеличивается . Гранулы гликогена появляются в начале брожения и постепенно исчезают к концу. По современным сведениям, гликоген у дрожжей Sacch. cerevisiae локализован снаружи цитоплазматической мембраны в периплазматическом пространстве и связан с нерастворимыми компонентами клеточных оболочек.

Липиды (жиры и жироподобные вещества), являясь важными компонентами цитоплазматических мембран органоидов клетки, выполняют и роль запасного питательного материала. Жиры дрожжей представляют собой смесь истинных жиров (глицеридов жирных кислот) с фосфолипидами (лецитин, кефалин) и сте-ролами (эргостеролом). Капельки жира в клетках дрожжей хорошо различимы в световом микроскопе благодаря тому, что они сильно преломляют свет. Особенно хорошо они видны у пленчатых дрожжей.

Фосфолипиды наряду со стеринами, каротиноидами и сквале-нами способствуют росту дрожжей и выполнению биосинтетических реакций в анаэробиозе .

В зависимости от вида и условий культивирования дрожжи способны синтезировать от 1 до 74% липидов в расчете на сухую массу. Наибольшей способностью накапливать липиды в клетках обладают дрожжи Rhodotorula gracile. В клетках дрожжей этого рода количество липидов может достигать 74% сухой массы клеток.

Метахроматин (волютин), в состав которого входят преимущественно полифосфаты, находится в состоянии коллоидного раствора в вакуолях и без окраски или осаждения фиксаторами как правило неразличим. Однако иногда в результате каких-то отклонений в клеточном обмене веществ в вакуолях можно наблюдать метахроматин, частично выпавший из раствора в виде сферических гранул, хорошо преломляющих свет и энергично броунирующих. Метахроматин используется при построении клеточного протопласта и как источник энергии. Поэтому количество его уменьшается при активных синтетических процессах и увеличивается при задержанном размножении .

Сера, иногда содержащаяся в протоплазме дрожжей, обнаруживается по сильному преломлению света. Отложение серы в клетках дрожжей приводит к появлению инволюционных форм .

Клетки некоторых родов дрожжей (Rhodotorula, Sporobolo-myces salmonicolor) окрашены в оранжевый и красный цвета, обусловленные содержанием пигментов, принадлежащих к группе каротиноидов. Дрожжи рода Candida (С. pulcherrima, С. reu-kaufii) на средах, содержащих железо, образуют колонии темно-красного цвета за счет красного пиразинового пигмента, в состав которого входит комплексно-связанное железо.

Итак, в структуре дрожжевой клетки содержатся различные вещества, изменения которых в результате биохимических процессов должны быть идеально согласованы между собой.

Переход клеток дрожжей от аэробного существования к анаэробному (брожение) сопровождается укрупнением ядра и ка-риосом, уменьшением содержания дезоксирибонуклеиновой кислоты; поверхность митохондрий по отношению к биомассе их вещества уменьшается; в клетках дрожжей бродильного типа обычно накапливаются метахроматин и гликоген.

Структура клеток дрожжей разных родов неодинакова. Установлено, что митохондрии, эндоплазматический ретикулум и оболочки клеток дрожжей Sacch. vini и Rhodotorula glutinis существенно различаются. Ультраструктурная организация клеток дрожжей Rh. glutinis более развита и специализирована, чем дрожжей Sacch. vini. У Rh. glutinis митохондрии более многочисленны, с более упорядоченной внутренней структурой, со значительно развитым и своеобразно построенным ретикулумом.

Страница 1 из 10

Часть третья
ДРОЖЖИ - ВОЗБУДИТЕЛИ СПИРТОВОГО БРОЖЕНИЯ

Глава 5. ЦИТОЛОГИЯ, СИСТЕМАТИКА И ЭКОЛОГИЯ ВИННЫХ ДРОЖЖЕЙ

В данной третьей части будут рассмотрены одноклеточные организмы, дрожжи и бактерии - возбудители брожений. Но сначала необходимо дать несколько определений для тех читателей, которые недостаточно знакомы с терминологией микробиологов.
Цитологией называют науку о клетке, ее морфологии, структуре, свойствах и функциях.
Для исследования микроорганизмов необходимо знать их положение в классификации. Систематика занимается такой классификацией и включает описание видов. Таксономия является наукой, которая исследует законы классификации.
Микроорганизмы подразделяют по сходству их морфологических, цитологических и физиологических характеристик. Их делят на классы, подклассы, порядки, семейства, роды, виды; расами называют различные штаммы дрожжей в рамках одного вида.
Чтобы лучше уяснить место, которое занимают микроорганизмы в живом мире, нужно иметь в виду, что известны три группы живых существ: две первых представлены растениями и животными, многоклеточными организмами с сильно развитой дифференциацией тканей; третью образуют простейшие организмы, одноклеточные или многоклеточные, но без тканевой дифференциации; они включают водоросли, простейшие одноклеточные организмы, грибы и бактерии.
Среди простейших организмов выделяют две подгруппы, различающиеся элементарной структурой их клетки: простейшие прокариоты, к которым относятся бактерии, и простейшие аукариоты, включающие грибы, и в частности дрожжи.
Грибы делятся на многие классы, среди которых находятся аскомицеты, размножающиеся половым путем и образующие споры (аскоспоры) внутри клетки с уплотненной оболочкой, называемой аском. Аскомицеты включают много семейств, среди которых находятся Saccharomycetaceae (см. табл. 5.2). К этому семейству принадлежат дрожжах опиртового брожения.
Но не все дрожжи образуют аски и, следовательно, не все являются аскомицетами; такие дрожжи принадлежат к семейству Cryptococcaceae (см. табл. 5.1). Другие дрожжи относятся к классу несовершенных грибов (Fungi imperfeeti), с бесполым размножением; дрожжи находят также в классе базидиомицетов.
Таким образом, в действительности термин «дрожжи» не является в полном смысле слова ботаническим; он обозначает не связанную с другими группу микроорганизмов, рассеянную в трех семействах грибов. Однако удобство такого термина, некоторое единство структуры, сходство формы и внешнего вида придают этой группе, несмотря на отдельные различия в физиологических свойствах, определенную монолитность.
Более детальные сведения по цитологии и систематике можно найти в работах по общей микробиологии (Ламбен и Жерман, 1961; Стание и сотрудники, 1966; Сенец, 1968; Шампаньят и сотрудники, 1969) и в недавно опубликованных монографиях о дрожжах (Роз и Харрисон, 1969- 1971). Имеется лишь небольшое количество монографий по микробиологии вина; заслуживают упоминания труды таких авторов, как Шандерль (1959), Америн и Кушке (1968), Кастелли (1969).

Цитология дрожжей

В целом структура дрожжевой клетки мало отличается от структуры клеток растения. Чтобы увидеть под микроскопом структуру молодой дрожжевой клетки, обнаружить различные органоиды, ее необходимо покрасить. В более старых клетках или в клетках, содержащих аскоспоры, можно непосредственно при микроскопировании различить некоторые детали внутреннего строения. Наблюдение с помощью электронного микроскопа позволило осуществить детальное исследование клеток различных видов дрожжей. Как и любой организм подгруппы аукариотов, дрожжевая клетка включает клеточную оболочку, цитоплазму и ядро (рис. 5.1).

Клеточная оболочка

Клеточная оболочка включает клеточную стенку, и дитоплазматическую мембрану. Клеточная стенка дрожжей относительно толстая и жесткая. В ее состав входят полисахариды - маннан и глюкан в примерно равном соотношении. У некоторых дрожжей маннан отсутствует. Кроме того, клеточная стенка содержит белки, липиды, фосфаты, глюкозамин и у большей части видов хитин. Внешний слой стенки образуется в первую очередь маннаном, глюкан же входит в состав промежуточного слоя, богатого белками.
Белки стенок состоят из обычных аминокислот, с сильной пропорцией глутаминовой и аспарагиновой кислот; они также богаты серусодержащими аминокислотами и находятся в виде комплексных соединений с полисахаридами.

Рис.5.1. , no Роуз и Харрисон, 1969:
1 - ядро; 2 - ядрышко; 3 - центриоль; 4 - ядерная оболочка; 5 - митохондрии; 6 - липидные зерна; 7 - цитоплазматическая мембрана; 8 - вакуоль; 9 - метахроматическая корпускула; 10 - клеточная стенка: 11 - рубец от почкования; 12 - цитоплазма.

На внутренней стороне стенки клетки локализованы ферменты: инвертаза, фосфатаза, пептидаза и другие гидролазы.
Оболочка дрожжевой клетки играет роль защитного покрытия, так как она устойчива против механического воздействия. Она придает клетке специфическую форму.
Подсчитано, что поверхность клеток, содержащихся в 1 л бродящего сусла, равна 10 м2, хотя по внешнему виду клеточная оболочка выглядит гладкой, фактически она представляет собой тонкую решетку, активная поверхность которой составляет еще большую площадь. Этим объясняется быстрота обмена веществ у дрожжей.
В то же время оболочка имеет относительно мелкие поры. Коллоиды с молекулярной массой более 4500 через них не проходят. В результате этого дрожжи не могут использовать белки среды непосредственно. Клеточную оболочку следует рассматривать как некий фильтр, пропускающий только макромолекулы. Роль ферментов стенки заключается в том, чтобы обеспечивать проникновение гидролизуемых веществ.
С помощью электронного микроскопа наблюдали на поверхности оболочки рубцы, образующиеся при последовательных почкованиях.
Цитоплазматическая мембрана сама состоит из трех исключительно тонких слоев, образованных липидами, белками, полисахаридами.
Роль мембраны сводится к контролю движения веществ, содержащихся во внешней среде, внутрь клетки и обратно. С одной стороны, мембрана пропускает питательные вещества к местам их ассимиляции: ноны, сахара, аминокислоты, витамины и другие, с другой - она контролирует выделение в среду продуктов метаболизма, таких, как этанол и другие вещества.
Этот непрерывный обмен между дрожжами и средой происходит посредством систем транспортеров. Они придают цитоплазматической мембране свойства высокоселективного фильтра.

Цитоплазма и ее органоиды

Обычно цитоплазма занимает большую часть объема клетки и содержит некоторое число органоидов, растворимые ферменты, в частности те, которые участвуют в процессе гликолиза.
В ней различают включения (гранулы гликогена) и органоиды, главными из которых являются рибосомы, вакуоли, митохондрии.
Рибосомы дрожжевой клетки наблюдаются пол электронным микроскопом рассеянными в цитоплазме. Химически они состоят из примерно одинаковых частей белков и нуклеиновых кислот. Полагают, что рибосомы являются местом синтеза белков.

Гликоген - полисахарид, довольно похожий на крахмал растении, находится почти во всех дрожжах; в некоторых условиях он может составлять до 40% их сухой массы. В начале брожения гликоген в клетках появляется в виде небольших скоплений с правильными очертаниями, разбросанных в цитоплазме, которые в дальнейшем быстро сливаются в большую массу, отталкивающую вакуоль и ядро к периферии. Гликоген легко обнаружить: при окрашивании клеток красителем с иодом он становится коричневым. К концу брожения он постепенно исчезает. Когда дрожжи спорулируют, гликоген накапливается в асках и используется аскоспорами во время их прорастания. Он является резервным веществом.

Другие часто встречающиеся запасные вещества - липиды - находятся в плазме дрожжей в виде гранул. Эти образования, преломляющие свет, очень хорошо различимы под микроскопом у пленчатых дрожжей, развивающихся на поверхности вин.

Вакуоли - это органоиды клетки, часто неправильной формы, ограниченные одной мембраной. В цитоплазме молодых клеток дрожжей содержится одна вакуоль, если они имеют сферическую или эллиптическую форму, и две вакуоли, расположенные соответственно на каждом из полюсов и связанных плотным цитоплазменным мостом, в котором находится ядро, если клетки удлиненные. Содержащие жидкость с кислой реакцией вакуоли отделены полупроницаемой мембраной от цитоплазмы, которая нейтральна или обладает слабой щелочностью. Вакуоли играют большую роль в явлениях осмоса, содержат соли, кислоты, сахара, белки и другие вещества.
Во время фазы роста вакуолярный аппарат не имеет видимых элементов структуры. В старых клетках вакуоль имеет сферические образования, состоящие из полиметафосфатов, которые за их легкую окрашиваемость назвали «метахроматическими корпускулами», а также полифосфатов, называемых валюгином.

В вакуолях находят также липиды и много гидролитических ферментов: протеазы, рибонуклеазы, эстеразы и др. Локализация этих гидролаз в вакуолях наводит на мысль, что эти органоиды представляют собой наиболее подходящее место для реализации реакции гидролиза. Вакуоли также являются местом аккумуляции пуринов, некоторых аминокислот, ионов калия и других веществ, которые здесь накапливаются до начала метаболизма.
Митохондрия встречается в различных формах: сферической, в виде палочек, нитей. Дрожжевая клетка содержит около дюжины митохондрий, которые имеют тенденцию располагаться вблизи ядра. Богатые липидами, фосфолипидами, эргостернном, митохондрии содержат нуклеиновые кислоты, отличные от тех, которые находятся в ядре и в рибосомах. Они содержат дыхательные ферменты, цитохромы, флавины, железо, медь и являются местом процесса дыхания; размеры их уменьшаются при дыхательной недостаточности, когда дрожжи культивируют в анаэробиозе или в среде, лишенной стеринов.

Ядро

Хотя ядро и имеет диаметр около 1 мкм, его трудно наблюдать при микроскопировании в живых дрожжах, развивающихся в жидкой среде; оно легче обнаруживается при фазово-контрольной микроскопии дрожжей, размножающихся в аэробных условиях. У почкующихся клеток ядро обычно наблюдается между почкой и вакуолью; сразу же после отделения почки оно перемещается в противоположную сторону материнской клетки.
Ядро окружено оболочкой; вокруг оболочки можно наблюдать в электронный микроскоп поры, которые исчезают и вновь образуются в разных точках мембраны. Во время почкования оболочка ядра не разрывается; ядро удлиняется, часть его проникает в почку.

Ядро состоит из двух ясно различимых частей; одна оптически плотная имеет форму полусферы и называется нуклеусом, над ней находится другая, более прозрачная часть в виде колпака нуклеоллазма.
Ядро содержит нуклеиновые кислоты, в частности рибонуклеиновую кислоту. Оно делится митотически, как все ядра эукариотных клеток.

Хромосомы дрожжей из-за малых размеров трудно обнаружить, и относительно их числа существуют противоречивые мнения. Для Saccharomces, elJipsoideus число хромосом, по-видимому, составляет не менее 13.